何林全 劉家云 屈園利 劉西濤 李曉東 龍 銦△

（1.空軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院，陜西 西安 710032；2.武警新疆總隊克拉瑪依市支隊衛(wèi)生隊，新疆 克拉瑪依 834000）

腦卒中，又稱“中風”，是一種急性腦血管疾病。流行病學調查顯示，腦卒中已成為我國第一大致死性疾病，同時也是全球第2大致死性疾病[1]。缺血性腦卒中（即腦梗死）的發(fā)病機制比較復雜，包括免疫炎性反應、細胞凋亡、能量衰竭和興奮性氨基酸細胞毒性作用、半暗帶去極化等。其中，急性腦梗死后觸發(fā)的免疫炎性瀑布反應扮演著重要角色[2]。研究表明，在腦梗死早期，高遷移率族蛋白B1（HMGB1）可大量釋放到細胞外并與晚期糖基化終末產物受體（RAGE）結合，促進炎性細胞的趨化作用，并通過激活促炎因子如核轉錄因子-κB（NF-κB）等誘導炎性反應[3]。 HMGB1/RAGE 信號通路在腦梗死引起神經(jīng)細胞死亡中的作用已經(jīng)成為目前研究的熱點。中醫(yī)學把腦梗死歸于 “中風”“卒中”“偏枯”范疇[4]。氣虛血瘀是腦梗死的重要病機，治法以益氣活血，方藥選用補陽還五湯。補陽還五湯由黃芪、當歸、赤芍、地龍、川芎、桃仁和紅花組成，是目前治療中風應用頻率最高的經(jīng)典名方[5]。本文通信作者龍銦副教授結合多年臨床經(jīng)驗對此方進行化裁，減去桃仁、紅花，加丹參、茯苓、陳皮，天麻、杜仲，并采用免煎顆粒劑，臨床用于治療腦梗死已取得較好的療效。本研究意在探討加味補陽還五顆粒對腦梗死大鼠HMGB1/RAGE信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 90只健康無特定病原體（SPF）級雄性SD大鼠，體質量（200±20）g，購自空軍軍醫(yī)大學動物實驗中心，生產批號：SCXK（軍）2012-0007。

1.2 實驗藥物 加味補陽還五顆粒（組成：黃芪6.0 g，當歸 3.0 g，川芎 1.3 g，赤芍 2.0 g，丹參 1.8 g，地龍 1.0 g，茯苓 0.5 g，陳皮 1.0 g，杜仲 0.7 g，天麻 2.0 g），每劑中藥顆粒劑含藥量19.3g，依據(jù)成人與大鼠體表面積換算（成人體質量按 60 kg 計算）：19.3/60×6.25=2.01 g/kg。因此，以2.01 g/kg為中等劑量，倍之即4.02 g/kg為高劑量，減半即1.0 g/kg為低劑量。使用時應使用沸水沖化，充分攪拌，待至溫時服用，均配制成1 mL藥液。使用廣東一方制藥有限公司生產的免煎顆粒劑。尼莫地平（正大青春寶藥業(yè)有限公司生產，批號H33022285，規(guī)格 20 mg/kg）。

1.3 試劑與儀器 HMGB1特異性抑制劑：重組大鼠HMGB1-A box蛋白由前期實驗合成。RAGE特異性阻斷劑：FPS-ZM1購自Selleck上海藍木化工有限公司，批號：S8185010001001。HMGB1和RAGE ELASA試劑盒購自南京建成生物技術有限公司，批號：20170315。一抗：兔多克隆抗體Anti-HMGB1購自Abcam（ab18256）公司，批號：GR290497-2。內參抗體：Anti-β-Actin 鼠單克隆抗體購自Sigma公司。二抗：IRDye 800CW山羊抗兔抗體購自 Rockland公司，批號：C10324-01。IRDye 680山羊抗鼠抗體購自Rockland公司，批號：B50908-02。 封閉液（Odyssey Blocking buffer）購自 LICOR公司，批號：X0022。高速低溫離心機，BIORIDGE，型號TGL-30M。雙色紅外激光成像系統(tǒng)，Odyssey公司，型號 X09A014362。 半干轉膜儀，Invitrogen，型號Y12B035513。 超聲粉碎機，SONICS，型號 VCX130。 干濕恒溫器，杭州奧盛儀器有限公司，型號K10CD。

1.4 模型制備 采用線栓法制備大鼠大腦中動脈缺血模型（MCAO）[6]。12%水合氯醛，3 mL/kg 腹腔注射麻醉，成功后采用頸正中切口，鈍性分離皮下組織，充分暴露右側頸總動脈及頸外動脈，用血管夾夾閉右側頸總動脈。采用線栓法經(jīng)右側頸外動脈-頸內動脈入路，至大腦中動脈入口處，固定線栓。2 h后拔去線栓，結扎右側頸外動脈，開放右側頸總動脈。神經(jīng)功能缺損評分參考Longa五級四分法，1～3分為有效模型。假手術組不進行線栓栓塞，僅進行頸部皮下組織的鈍性分離，以及皮膚縫合及消毒。剔除死亡、評分為0分和未麻醉成功的大鼠。

1.5 分組及干預方法 健康雄性SD大鼠90只，按體質量用數(shù)字表法隨機分為正常組、假手術組、模型組、加味補陽還五顆粒低劑量組（1 g/kg）、加味補陽還五顆粒中劑量組（2.01 g/kg）、加味補陽還五顆粒高劑量組（4.02 g/kg）、HMGB1 抑制劑組 （GST-A，500 μg/只，腹腔注射）、RAGE 阻斷劑組（FPS-ZM1，1.0 mg/kg，腹腔注射）、陽性藥物組（尼莫地平，12.5 mg/kg）各10只。平衡飼養(yǎng)，加味補陽還五顆粒高、中、低劑量組分別按以上給藥劑量，用煮沸蒸餾水充分溶解，待晾至室溫后配制成等體積的藥液，于造模前連續(xù)灌胃10 d，每日1劑，分兩次灌胃給藥。其余各組均給予同上等體積的蒸餾水灌胃10 d。造模成功后，加味補陽還五顆粒高、中、低劑量組、RAGE阻斷劑組、HMGB1抑制劑組、陽性藥物組按給藥劑量連續(xù)給藥2 d；正常組、假手術組和模型組給予蒸餾水灌胃2 d。以上各組給藥體積相同。為保證最終實驗結果統(tǒng)計需要適當增加大鼠造模數(shù)量。剔除造模及給藥過程中死亡的大鼠，使最終每組大鼠數(shù)量為10只。

1.6 標本采集與檢測 1）HMGB1、RAGE含量檢測。造模后第3天，以12%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，經(jīng)腹主動脈采血。血標本于室溫放置20 min，3000 r/min離心15 min后取上清，于-80℃保存待用。ELISA法檢測血清中HMGB1、RAGE含量，方法參照南京建成生物技術有限公司提供的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒使用說明書。2）腦組織HMGB1/β-actin表達檢測。采血后立即開顱取腦，置于冰生理鹽水中5 min。切取梗死區(qū)腦組織并稱重，置于研缽中，加入適量冰PBS充分研磨，制成10%的混懸液。4℃、8000 r/min離心10 min。取上清，用0.22 μm過濾器過濾，置干凈的EP管中。各取 50 μL上清，分別加入 12.5 μL 5×蛋白上樣緩沖液，100℃水浴10 min，完成后迅速放入冰盒中冷卻 3 min。將 6 μL 蛋白 marker，20 μL 蛋白樣品依次加入電泳槽中，初始電壓為90 V，20 min。待marker和樣品壓縮為一條直線后，將電壓設定為120 V，60 min。待marker各條帶到達合適位置時終止電泳。電泳完畢后，將膠小心取下，放入干凈的平底玻璃皿中，切除壓縮膠，將分離膠裁剪至合適大小。采用半干轉印法，按照濾紙-膠-膜-濾紙的順序依次放置在半干轉膜儀中，23 V，8 min。將硝酸纖維素膜小心裁剪至合適大小，小心取下，放置在盛有適量封閉液的容器中，室溫于水平搖床60 r/min、2 h。加入兔抗HMGB1多克隆抗體（1∶10000）、Anti-β-Actin 鼠單克隆抗體（1∶5000），4℃冰箱中過夜；加入IRDye 800CW山羊抗兔熒光二抗（1∶10000）、IRDye 680 山羊抗鼠熒光二抗 （1∶10000），室溫于水平搖床72 r/min孵育1 h；充分洗滌后，利用Odyssey雙紅外激光成像系統(tǒng)分別掃描膠與硝酸纖維素膜，采集圖像。

1.7 統(tǒng)計學處理 應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，采用非參數(shù)檢驗，組間多重比較采用Nemenyi檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠血清HMGB1、RAGE水平比較 見表1。模型組大鼠血清中HMGB1水平高于其他組，各給藥組大鼠血清中HMGB1水平較假手術組有下降趨勢。其中模型組大鼠血清中HMGB1水平明顯高于正常組（P＜0.05）；加味補陽還五顆粒中劑量組、陽性藥物組與模型組存在明顯差異（P＜0.05）。以上結果說明模型構建成功，中等劑量加味補陽還五顆?？山档驮炷：蟠笫笱逯械腍MGB1水平。對照組大鼠血清中RAGE水平高于其他組，各給藥組大鼠血清中RAGE水平較模型組有下降趨勢。其中模型組與正常組存在明顯差異（P＜0.01）；加味補陽還五顆粒中劑量組、陽性藥物組與模型組存在明顯差異（P＜0.05）。以上結果說明模型構建成功，中等劑量加味補陽還五顆?？山档驮炷：蟠笫笱逯械腞AGE水平。

表 1 各組大鼠血清 HMGB1、RAGE水平比較（ng/mL，±s）

表 1 各組大鼠血清 HMGB1、RAGE水平比較（ng/mL，±s）

與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。 下同

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2.2 各組Western blotting結果比較 見表2，圖1。對照組HMGB1/β-Actin對照比值明顯高于正常組，差異明顯（P＜0.05）；各給藥組 HMGB1/β-Actin 灰度比值較模型組有下降趨勢，差異明顯，其中HMGB1抑制劑組與模型組存在明顯差異（P＜0.05），加味補陽還五顆粒中劑量組、陽性藥物組與模型組存在明顯差異（P＜0.01）。以上結果說明模型構建成功，中等劑量加味補陽還五顆?？山档驮炷：蟠笫蠊Ｋ绤^(qū)腦組織中HMGB1表達水平。

表2 各組大鼠腦組織HMGB1/β-actin表達比較（灰度值，±s）

表2 各組大鼠腦組織HMGB1/β-actin表達比較（灰度值，±s）

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圖1 各組大鼠腦梗死區(qū)組織Western Blotting結果

3 討 論

綜觀本病，患者由于臟腑功能失和，氣血素虛或痰濁、瘀血內生，導致瘀血阻滯、痰熱內蘊，或陽化風動、血隨氣逆，引起腦脈痹阻，從而出現(xiàn)昏仆不遂，發(fā)為中風。往往因內因、外邪、情志不暢等而誘發(fā)。中風病病位在腦，與五臟密切相關。其病機有虛、火、風、痰、氣逆、血瘀，多相互交織而復雜多變。病性多為本虛標實，上盛下虛。而其基本病機為氣血逆亂，上犯于腦，腦之神明失用[7]。

治療中風如無明顯的標急現(xiàn)象，則往往二陳湯與四物湯同用，標本兼治，化痰不致傷陰，養(yǎng)血不致滋膩。晚清及近代醫(yī)家張伯龍、張山雷、張壽甫等人結合西醫(yī)理論，發(fā)現(xiàn)中風病主要發(fā)生于年老體衰之人，此時肝腎不足，水不涵木，肝陽化風，氣血并逆，直沖犯腦。本研究的加味補陽還五顆粒是本文通信作者龍銦副教授根據(jù)以上名家理論，在補陽還五湯原方基礎上減去桃仁、紅花，加丹參、茯苓、陳皮，天麻、杜仲，并采用免煎顆粒劑而組成，既能補氣活血、化痰通絡，還能平肝息風。

補陽還五湯治療腦梗死的機制主要表現(xiàn)在兩個方面：腦保護作用及促進神經(jīng)功能恢復。研究表明，補陽還五湯通過抑制與炎癥及細胞凋亡相關的基因的表達[8]，從而有效抑制腦梗死患者血清中 hs-CRP、IL-1β和MMP-9等炎性因子的釋放，進而明顯降低急性腦梗死患者血清IL-1β、IL-6及IL-18表達水平，從而有效抑制炎性反應，進而保護腦組織[9-10]；可明顯降低表達細胞周期蛋白，從而通過調節(jié)細胞周期信號通路發(fā)揮腦保護作用[11]；能夠通過抑制腦缺血/再灌注引起的促代謝性谷氨酸受體-5的表達，增加垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽（PACAP-38）的表達，從而顯著增加谷氨酸轉運蛋白1和和谷氨酰胺合成酶的表達，以此抑制興奮性神經(jīng)毒性，發(fā)揮腦保護作用[12-13]。研究表明，補陽還五湯能夠激活內源性神經(jīng)干細胞及抑制軸突生長抑制蛋白[14]；能夠明顯上調雙皮質素的表達，以增加細胞衍生因子和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子mRNA及蛋白的表達，從而促進神經(jīng)干細胞從室管膜下層遷移[13，15]；能夠增加腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和血管內皮生長因子蛋白表達，明顯增加腦梗死大鼠神經(jīng)形成，促進腦梗死大鼠神經(jīng)功能的恢復[16]。

本研究觀察加味補陽還五顆粒對腦梗死大鼠的腦保護作用，特別是對HMGB1/RAGE信號軸的影響。通過構建MCAO大鼠模型，以血清和腦組織中HMGB1和RAGE表達水平作為觀察指標；設置陰性對照組即模型組，陽性藥物對照組即尼莫地平組，RAGE阻斷劑組、HMGB1抑制劑組，分別從HMGB1和RAGE表達水平兩個方面驗證加味補陽還五顆粒對HMGB1/RAGE信號軸的影響；設置加味補陽還五顆粒高劑量組，加味補陽還五顆粒中劑量組，加味補陽還五顆粒低劑量組，進一步明確劑量與預后的關系。

本研究于造模第3天采血，ELISA結果顯示模型組大鼠血清中HMGB1、RAGE含量明顯高于其他組，可見在缺血性腦梗死急性期，HMGB1、RAGE表達水平是升高的。大鼠梗死區(qū)腦組織Western blotting結果顯示，模型組HMGB1表達水平明顯高于其他組，說明HMGB1及其信號通路參與了腦梗死后的炎癥反應過程。ELISA和Western blotting結果中，加味補陽還五顆粒中劑量組HMGB1、RAGE表達水平均較模型組有顯著差異，然而加味補陽還五顆粒高劑量組和加味補陽還五顆粒低劑量組與模型組比較，無顯著差異，說明中等劑量的加味補陽還五顆?？擅黠@影響腦梗死大鼠的預后。中等劑量的加味補陽還五顆粒，折合人體劑量后每味藥劑量如下：其中黃芪30 g，當歸10 g，川芎6 g，赤芍 10 g，丹參 10 g，地龍 10 g，茯苓 10 g，陳皮 6 g，杜仲10 g，天麻10 g。成人每日1劑，分2次服用。

綜上所述，中等劑量的加味補陽還五顆?？赡苁亲罴阎委焺┝俊＜游堆a陽還五顆?？赡芡ㄟ^調控腦梗死大鼠HMGB1/RAGE信號通路而發(fā)揮腦保護作用。下一步我們將繼續(xù)探討HMGB1/RAGE信號通路對HMGB1/RAGE信號通路上下游分子的影響，進一步闡明加味補陽還五顆粒影響HMGB1/RAGE信號通路相關機制。