徐士儒，姚志鴻，熊風(fēng)，李觀(guān)貴，孫青，萬(wàn)才云，陳培林，鐘惠嫻，曾勇

(深圳中山泌尿外科醫(yī)院生殖中心，深圳市圍著床期生殖免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳中山生殖與遺傳研究所，深圳 518045)

體外受精-胚胎移植(IVF-ET)中，胚胎培養(yǎng)環(huán)境是影響胚胎生長(zhǎng)發(fā)育及IVF-ET結(jié)局的重要因素[1]。在體內(nèi)，胚胎在母體子宮中發(fā)育，是一個(gè)恒溫恒濕的穩(wěn)定生理環(huán)境[2]。但在體外，胚胎通常培養(yǎng)在培養(yǎng)皿微滴里，依靠CO2培養(yǎng)箱維持微滴一個(gè)類(lèi)似子宮的穩(wěn)定環(huán)境。然而，目前的胚胎培養(yǎng)方式，仍不可避免將胚胎移出培養(yǎng)箱行離箱觀(guān)察及操作。離開(kāi)CO2培養(yǎng)箱的胚胎可能面臨溫度、pH值及滲透壓等變化所導(dǎo)致的應(yīng)激反應(yīng)，影響胚胎的發(fā)育潛能。我們主觀(guān)上盡量減少離箱操作時(shí)間，選擇快速恢復(fù)培養(yǎng)皿內(nèi)微滴溫度等條件的胚胎培養(yǎng)箱。但仍無(wú)相關(guān)數(shù)據(jù)表明微滴在離箱操作過(guò)程中溫度的變化及操作時(shí)間是否合理及培養(yǎng)箱中微滴的復(fù)溫時(shí)間的長(zhǎng)短。因此，本研究利用商品化溫度測(cè)定儀自組裝一套簡(jiǎn)易的微滴溫度檢測(cè)裝置，對(duì)離箱操作條件下微滴溫度變化及放回不同類(lèi)型CO2培養(yǎng)箱后微滴溫度恢復(fù)時(shí)間進(jìn)行檢測(cè)，為胚胎實(shí)驗(yàn)室臨床工作提供理論指導(dǎo)。

材料與方法

一、研究對(duì)象

1.試劑與耗材：配子受精培養(yǎng)液，血清蛋白替代物(SPS)，組織培養(yǎng)油均購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)SAGE公司，4℃冰箱保存。3001胚胎培養(yǎng)皿和定量移液管分別購(gòu)買(mǎi)于美國(guó) BD FALCON和美國(guó)COSTAR公司。熱平板(MATS-UST2)為日本Tokai hit公司產(chǎn)品，使用前校準(zhǔn)至37℃。研究中涉及的大型箱式培養(yǎng)箱(C200，Labotect，德國(guó))(#1)，小型箱式培養(yǎng)箱(APM-30D，Astec，日本)(#2)，桌面干式培養(yǎng)箱(EC9-230L1，Astec，日本)(#3)，桌面濕式培養(yǎng)箱(K-MINC-100，COOK，美國(guó))(#4)為胚胎實(shí)驗(yàn)室常用的三氣CO2培養(yǎng)箱，設(shè)置參數(shù)至37℃，5%CO2，5%O2。溫度測(cè)定儀(EA11A)購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)Extech公司，手工將其溫度探頭與3001胚胎培養(yǎng)皿皿蓋偶聯(lián)(圖1)，用于測(cè)定培養(yǎng)皿中微滴溫度，使用前參照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)校準(zhǔn)。

二、研究方法

1.本研究涉及4種不同類(lèi)型的商品化培養(yǎng)箱，1號(hào)(#1)為大型箱式培養(yǎng)箱；2號(hào)(#2)為小型箱式培養(yǎng)箱；3號(hào)(#3)為桌面干式培養(yǎng)箱；4號(hào)(#4)為桌面濕式培養(yǎng)箱。

2.培養(yǎng)皿及微滴準(zhǔn)備：實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)皿及微滴與胚胎培養(yǎng)室常規(guī)工作中的培養(yǎng)皿及微滴準(zhǔn)備方法相同。即在3001胚胎培養(yǎng)皿中加入35 μl含10% SPS的配子受精培養(yǎng)液并立即加入2.5 ml組織培養(yǎng)油。準(zhǔn)備好的培養(yǎng)皿放置37℃，5%CO2，5%O2條件下平衡。

3.熱平板上微滴溫度測(cè)量：連接培養(yǎng)皿中的溫度探頭至溫度測(cè)定儀，待溫度穩(wěn)定后讀數(shù)，快速取出，置于熱平板上，每隔30 s記錄一次溫度測(cè)定儀示數(shù)，共記錄30 min(圖1)。該測(cè)量進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

圖1 培養(yǎng)皿微滴溫度測(cè)定示意圖

4.培養(yǎng)箱內(nèi)微滴溫度測(cè)量：取出平衡后的培養(yǎng)皿，溫度下降至30℃時(shí)，快速放回培養(yǎng)箱，記錄溫度每升高0.5℃所需時(shí)間，直到最終穩(wěn)定在37℃。每種型號(hào)培養(yǎng)箱共進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、測(cè)量時(shí)培養(yǎng)室內(nèi)環(huán)境

培養(yǎng)室內(nèi)環(huán)境如溫濕度是胚胎培養(yǎng)室每日常規(guī)質(zhì)量控制指標(biāo)，胚胎培養(yǎng)過(guò)程中需要維持實(shí)驗(yàn)室內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)在胚胎實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，測(cè)量時(shí)培養(yǎng)室內(nèi)的溫度為(25.0±0.5)℃，相對(duì)濕度為(73%±7.8%)，實(shí)驗(yàn)中均關(guān)閉百級(jí)層流系統(tǒng)，每次測(cè)量時(shí)培養(yǎng)室內(nèi)環(huán)境保持相對(duì)穩(wěn)定。

二、熱平板上微滴溫度變化

隨著培養(yǎng)皿離開(kāi)CO2培養(yǎng)箱，在熱平板上操作時(shí)間的延長(zhǎng)，微滴內(nèi)的溫度呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)(圖2)。離箱操作3 min，微滴溫度降至(36.50±0.52)℃；離箱操作5 min，微滴溫度降至(36.17±0.67)℃；10 min時(shí)降至(35.53±0.64)℃；10 min以后，微滴溫度趨于平穩(wěn)，直到30 min時(shí)，微滴溫度仍能維持在(35.23±0.21)℃。

圖2 培養(yǎng)皿中微滴在熱平板上溫度變化

三、不同類(lèi)型商品化培養(yǎng)箱中微滴復(fù)溫時(shí)間

#1至#4培養(yǎng)箱中微滴溫度由30℃恢復(fù)至37℃的時(shí)間分別為(10.13±1.86)min、(24.71±4.37)min、(8.69±0.58)min、(8.59±2.01)min；由35℃恢復(fù)至37℃的時(shí)間分別為(5.58±1.37)min、(15.69±5.19)min、(5.21±0.45)min、(4.88±0.51)min。其中#2培養(yǎng)箱由30℃及35℃恢復(fù)至37℃的復(fù)溫時(shí)間均顯著長(zhǎng)于#1、#3、#4培養(yǎng)箱(P<0.05)，#4培養(yǎng)箱恢復(fù)至37℃的時(shí)間最短，但統(tǒng)計(jì)學(xué)上#1、#3、#4培養(yǎng)箱的復(fù)溫時(shí)間無(wú)顯著性差異(P>0.05)(圖3)。

注：與#1、#3、#4 CO2培養(yǎng)箱相比，*P<0.05圖3 不同類(lèi)型商品化培養(yǎng)箱中微滴復(fù)溫時(shí)間

討 論

體外胚胎培養(yǎng)是IVF-ET過(guò)程涉及的主要環(huán)節(jié)之一，胚胎的質(zhì)量直接影響移植后的最終臨床結(jié)局。除去配子及胚胎本身質(zhì)量外，影響胚胎培養(yǎng)的外部因素很多。從胚胎實(shí)驗(yàn)室角度，主要有環(huán)境因素、操作因素等，其中環(huán)境因素多而復(fù)雜，影響明顯。環(huán)境因素主要包括培養(yǎng)室內(nèi)環(huán)境、培養(yǎng)箱內(nèi)環(huán)境、培養(yǎng)皿微滴內(nèi)環(huán)境，如溫度、pH等。然而，由于監(jiān)控的復(fù)雜性，目前胚胎實(shí)驗(yàn)室廣泛關(guān)注的是培養(yǎng)室內(nèi)環(huán)境及培養(yǎng)箱內(nèi)環(huán)境，很少對(duì)培養(yǎng)皿微滴內(nèi)的環(huán)境進(jìn)行質(zhì)量控制。但是培養(yǎng)皿微滴是胚胎直接接觸的液體環(huán)境，相當(dāng)于母體子宮，所以微滴內(nèi)的環(huán)境才是關(guān)鍵的因素之一。因此，本研究關(guān)注于胚胎培養(yǎng)皿微滴內(nèi)的環(huán)境，通過(guò)自組裝的一套簡(jiǎn)易裝置實(shí)現(xiàn)對(duì)培養(yǎng)皿微滴內(nèi)溫度的監(jiān)控，探究培養(yǎng)皿離開(kāi)培養(yǎng)箱放置于熱平板上的溫度改變情況以及重新放回培養(yǎng)箱后的復(fù)溫時(shí)間，指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室日常工作，為胚胎培養(yǎng)體外操作及如何選擇更加適合的培養(yǎng)箱提供重要依據(jù)。

溫度對(duì)胚胎發(fā)育的影響顯而易見(jiàn)，人的基礎(chǔ)體溫是37℃，常規(guī)理論認(rèn)為，37℃是配子體外受精及胚胎發(fā)育的最適溫度[3-4]。然而，有動(dòng)物研究表明，輸卵管局部的溫度低于中心體溫1.5℃左右[5-8]，而人卵泡內(nèi)溫度甚至比中心體溫低2.3℃[9-10]。因此，根據(jù)“回歸自然”(back to nature)的胚胎培養(yǎng)理念提出，比37℃略低的溫度(如36℃)可能更有利于胚胎發(fā)育[9]。Higdon等[11]一項(xiàng)回顧性研究結(jié)果也表明，36℃的培養(yǎng)箱環(huán)境能夠提高臨床妊娠率。Hong等[12]的前瞻性隨機(jī)對(duì)照(RCT)研究結(jié)果表明，相比36℃培養(yǎng)環(huán)境，傳統(tǒng)的37℃條件培養(yǎng)，能夠獲得更好的第3天胚胎及更高的囊胚形成率，但是胚胎非整倍體率及移植后的妊娠率無(wú)顯著性差異。因此，目前對(duì)于胚胎培養(yǎng)的最適溫度仍然存在著爭(zhēng)議。但是，過(guò)低的溫度對(duì)于配子及胚胎的損傷是明確的，低溫除了降低胚胎內(nèi)正常代謝外，主要影響紡錘體的形態(tài)及穩(wěn)定性，對(duì)其他細(xì)胞期的影響也是不可避免的，造成不可逆的細(xì)胞損傷，影響胚胎質(zhì)量及種植潛能，導(dǎo)致受精率，卵裂率和妊娠率下降[13-16]。有研究表明，成熟卵母細(xì)胞在33℃下，紡錘體會(huì)在5 min內(nèi)開(kāi)始解聚，10 min內(nèi)完全消失，隨著溫度的降低，完全消失的時(shí)間將逐漸縮短，紡錘體恢復(fù)的時(shí)間將延長(zhǎng)，甚至是永久性損傷[17]，低溫也會(huì)使得卵母細(xì)胞的非整倍體幾率增加[18]。

體外胚胎培養(yǎng)過(guò)程中，目前仍無(wú)法實(shí)現(xiàn)從開(kāi)始到結(jié)束胚胎始終不離開(kāi)培養(yǎng)箱，因此，低于37℃的溫度是不可避免的，主要出現(xiàn)在兩種情況：一種是從培養(yǎng)箱取出胚胎培養(yǎng)皿放置于恒溫?zé)崞脚_(tái)上進(jìn)行離箱操作及觀(guān)察；另外一種是培養(yǎng)皿從箱外回到培養(yǎng)箱尚未恢復(fù)溫度。因此，離箱操作所用時(shí)間內(nèi)引起的培養(yǎng)皿微滴溫度變化幅度及培養(yǎng)箱復(fù)溫能力十分重要。本研究結(jié)果表明，培養(yǎng)皿離開(kāi)CO2培養(yǎng)箱，隨著在熱平板上操作時(shí)間的延長(zhǎng)，微滴內(nèi)的溫度呈現(xiàn)逐漸降低，前10 min內(nèi)每分鐘溫度降低約0.16℃。10 min以后，微滴溫度趨于平穩(wěn)。由于目前對(duì)于胚胎培養(yǎng)的最適溫度仍有爭(zhēng)議，所以對(duì)于溫度低于多少開(kāi)始對(duì)配子及胚胎產(chǎn)生影響尚不明確，2010年美國(guó)生殖年會(huì)上，Sherbhn[19]在報(bào)告中提到，取卵時(shí)卵泡液溫度超過(guò)36.4～36.9℃這一范圍，將影響胚胎囊胚形成率、著床率及活產(chǎn)率，提示配子及胚胎在體外離開(kāi)培養(yǎng)箱后，溫度降至36.4℃下，可能開(kāi)始對(duì)后期發(fā)育產(chǎn)生影響。因此，結(jié)合本研究結(jié)果，為保證在熱平板上微滴內(nèi)的溫度能夠維持在36.4℃以上，建議離箱操作配子及胚胎的時(shí)間應(yīng)盡量控制在3 min以?xún)?nèi)，對(duì)于卵母細(xì)胞數(shù)或者胚胎數(shù)較多的情況，可以采用分批操作的方法，減少每一批次體外操作的時(shí)間，從而維持胚胎在一個(gè)適宜的環(huán)境下。完成離箱觀(guān)察和操作的配子應(yīng)立即放回培養(yǎng)箱中恢復(fù)至適宜溫度。因此，選擇合適的胚胎培養(yǎng)箱，在最短的時(shí)間內(nèi)恢復(fù)培養(yǎng)皿中微滴溫度也非常必要。

CO2培養(yǎng)箱是胚胎實(shí)驗(yàn)室的最常用的設(shè)備之一，主要用于控制胚胎培養(yǎng)環(huán)境。通過(guò)在培養(yǎng)箱內(nèi)模擬形成一個(gè)類(lèi)似人體內(nèi)的生長(zhǎng)環(huán)境，即穩(wěn)定的溫度、O2水平、CO2水平、相對(duì)濕度等，目前商品化培養(yǎng)箱品牌多、種類(lèi)雜。如何選擇一個(gè)好的培養(yǎng)箱尚缺乏行之有效的指標(biāo)，不同的研究者也有不同的結(jié)論[20]。其中，復(fù)溫時(shí)間可能是一個(gè)十分重要的參考指標(biāo)。本研究系統(tǒng)性的檢測(cè)了目前市面上比較典型的大型箱式培養(yǎng)箱(#1)，小型箱式培養(yǎng)箱(#2)，桌面干式培養(yǎng)箱(#3)和桌面濕式培養(yǎng)箱(#4)的復(fù)溫時(shí)間。結(jié)果顯示微滴在4種不同類(lèi)型的CO2培養(yǎng)箱中由30℃恢復(fù)至37℃的時(shí)間存在差異，分別為(10.13±1.86)min、(8.69±0.58)min、(24.71±4.37)min、(8.59±2.01)min，由35℃恢復(fù)至37℃的時(shí)間分別為(5.58±1.37)min、(5.21±0.45)min、(15.69±5.19)min、(4.88±0.51)min。其中，#2小型箱式培養(yǎng)箱的復(fù)溫時(shí)間顯著長(zhǎng)于#1、#3、#4培養(yǎng)箱(P<0.05)，#4培養(yǎng)箱的復(fù)溫速率最快，恢復(fù)至37℃所用時(shí)間最短，但#1、#3、#4培養(yǎng)箱的復(fù)溫時(shí)間彼此之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。因此，從溫度方面進(jìn)行考慮，應(yīng)盡可能選擇復(fù)溫時(shí)間較短的培養(yǎng)箱進(jìn)行胚胎培養(yǎng)，而在熱平板上進(jìn)行體外操作及觀(guān)察時(shí)則盡可能將時(shí)間控制在3 min之內(nèi)。若需在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行不同培養(yǎng)箱的數(shù)據(jù)監(jiān)控，則還需要結(jié)合其他指標(biāo)，如pH的控制、系統(tǒng)穩(wěn)定性、以及使用的便捷性等數(shù)據(jù)。當(dāng)然，無(wú)論選擇何種胚胎培養(yǎng)箱，最終還是應(yīng)關(guān)注胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育結(jié)局及臨床結(jié)局，才能更好的對(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行質(zhì)量控制。