齊亞楠，劉文嬌，梅雪昂，馬婧，韓瑞鈺，馬姣英，王樹松，，*

(1.河北醫(yī)科大學研究生學院，石家莊 050017；2.河北師范大學化學與材料科學學院，石家莊 050024；3.河北省計劃生育科學技術研究院/國家衛(wèi)生和計劃生育委員會計劃生育與優(yōu)生重點實驗室，石家莊 050071)

肥胖已經成為一個全球性的問題。有研究顯示，我國35～64歲人群肥胖率高達20.2%，超重率更是超過了38.8%[1]。哺乳動物體內脂肪根據功能可分為白色脂肪組織和棕色脂肪組織，兩者在肥胖發(fā)生機制中的作用恰好相反。因此，脂肪細胞分化調控機制一直是肥胖領域研究的熱點。PRDM蛋白家族是一類具有鋅指結構的蛋白轉錄因子，目前在人體組織和細胞中共發(fā)現了17種[2]。有研究顯示，PRDM16在棕色脂肪形成過程中起到分子開關的作用，可通過誘導棕色脂肪形成過程中基因的表達，增強線粒體解偶聯呼吸作用，使機體多余的能量以熱能的形式散發(fā)，從而抑制肥胖[3-4]。目前，精液常規(guī)分析仍然是衡量男性生育力和精子質量的主要指標[5]，因此我們同時對大鼠精液參數進行了分析。本課題組通過前期研究發(fā)現，鋅相關蛋白與男性生殖密切相關(待發(fā)表)，而PRDM16又是與肥胖相關的鋅指蛋白，因此本研究構建了肥胖大鼠模型，通過免疫組織化學、實時熒光定量PCR和免疫印跡試驗(Western Blot)技術檢測鋅指蛋白PRDM16在大鼠睪丸、睪周脂肪中的表達及在睪丸中的定位，探討鋅指蛋白PRDM16、肥胖和生殖的關系。

材料與方法

一、實驗動物

1.實驗動物及肥胖動物模型的建立：清潔級雄性SD大鼠20只，平均體重為(103±11)g，購買于河北醫(yī)科大學動物實驗中心。實驗大鼠適應性喂養(yǎng)一周后，將20只SD大鼠隨機分成正常組6只和肥胖組14只；其中正常組給予普通飼料喂養(yǎng)，肥胖組給予高脂飼料喂養(yǎng)。期間自由進食水，標準鼠籠喂養(yǎng)，每籠3只，飼養(yǎng)溫度為20～25℃，每周對大鼠體重進行檢測。12周末，肥胖組大鼠體質量大于正常組平均體質量的20%為肥胖模型構建成功。最終成功建立肥胖大鼠模型7只。

2.樣品的制備：采用10%的水合氯醛溶液對大鼠進行腹腔麻醉，取大鼠睪丸組織和雙側睪周脂肪稱重并記錄，部分睪丸組織放入10%的甲醛溶液中固定，其余立即放入液氮中，最終放置-80℃保存待用。

二、方法

1.HE染色：10%的甲醛固定不同組大鼠睪丸組織，石蠟包埋，切片烤片，常規(guī)脫蠟復水；蘇木素染色2 min，自來水沖洗，鹽酸酒精分化3 s，自來水沖洗后氨水返藍3 s，自來水沖洗，伊紅染色30 s；自來水沖洗后梯度酒精脫水，中性樹膠封片。

2.免疫組織化學：10%的甲醛固定不同組大鼠睪丸組織，石蠟包埋，切片烤片，脫蠟復水；PBS洗滌3次，枸櫞酸鈉抗原修復，室溫自然冷卻，洗滌后用3%的過氧化氫孵育40 min；PBS洗滌3次，山羊血清封閉1 h，滴加抗體PRDM16(PA5-20872，Thermo Fisher，美國)，其中一抗用PBS以1∶100的比例稀釋，4℃過夜；PBS洗滌3次，滴加生物素標記山羊抗兔IgG工作液(SP-9001，北京中杉金橋)室溫孵育1 h；洗滌后加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液孵育30 min，PBS洗滌3次，DAB(北京中杉金橋)顯色，蘇木素復染、中性樹膠封片。陽性染色為棕黃色。

3.實時熒光定量PCR：稱取不同組大鼠睪丸、睪周脂肪于無酶微量離心管(EP)管中，用動物組織總RNA提取試劑盒(ZP404，北京莊盟國際)提取睪丸及睪周脂肪組織總RNA，并按照說明書逆轉為cDNA，并以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR擴增PRDM16。

PRDM16引物序列：F 5’-CACAACTTGCTGGTCAAGGC-3’，R 5’-GCAGGTTTGGCCTCTTTTGG-3’；

β-actin引物序列：F 5’-ACCCGCGAGTACAACCTTCT-3’，R 5’-GATGCCTCTCTTGCTCTGGG-3’。

PCR反應條件如下：94℃預變性3 min；94℃15 s、63.2℃30 s、72℃30 s，共35個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。以β-actin基因作為內參。

分別以正常組大鼠睪丸及睪周脂肪組織為代表1倍目的基因表達量的校準樣品，以2-△△CT法計算肥胖組大鼠睪丸及睪周脂肪中的相對表達量。

4.Western Blot：稱取不同組大鼠睪丸組織及睪周脂肪于微量離心管(EP)管中，500 ml裂解液+5 μl PSMF充分剪碎并超聲裂解5 min，離心取上清，用BCA試劑盒(PQ0012，杭州聯科生物)測蛋白濃度，并計算蛋白上樣量；按SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(ZD304A，北京莊盟國際)說明書，PRDM16配制8%的分離膠，內參β-actin配制10%分離膠，濃縮膠為5%，濃縮膠恒壓為80 V，分離膠恒壓120 V，200 mA，1.5 h轉膜到硝酸纖維素膜上；5%的脫脂奶粉封閉1.5 h，一抗PRDM16(PA5-20872，Thermo Fisher，美國)以1∶1 000稀釋，內參β-actin(ARH4149，Antibody Revolution，美國)以1∶2 000稀釋，4℃孵育過夜；再將標記HPR的羊抗兔二抗(D110058，BBI Life Sciences，美國)用5%脫脂奶粉以1∶8 000稀釋，室溫孵育1.5 h，ECL化學發(fā)光試劑盒(ZD310A，北京莊盟國際)顯影。采用Image J2X軟件分析樣品目的條帶和相應內參條帶的灰度值，樣本PRDM16蛋白的相對表達量以目的條帶與內參條帶灰度值的比值表示，分析不同組睪丸及睪周脂肪中PRDM16蛋白表達情況。

5.大鼠精液參數分析：取新鮮大鼠附睪尾部，在生理鹽水中剪碎，充分混勻后，取10 μl混合液加入精子計數板中，記錄精子濃度和精子活力。

三、統(tǒng)計學分析

采用SPSS 21.0軟件對實驗數據進行分析。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、兩組大鼠體重、睪丸及睪周脂肪結果

與正常組相比，肥胖組大鼠體重和睪周脂肪質量均顯著增加，而睪丸/體重比值顯著降低(P<0.05)；肥胖組與正常組大鼠睪丸質量無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(表1)。

表1 正常組和肥胖組大鼠體重、睪丸和睪周脂肪比較(-±s)

注：與正常組比較，*P<0.05

二、兩組大鼠精液參數分析

對正常組和肥胖組大鼠精液分析發(fā)現，肥胖組大鼠精子濃度和活力顯著低于正常組(P<0.05)(表2)。

表2 正常組和肥胖組大鼠精液參數分析(-±s)

注：與正常組比較，*P<0.05

三、兩組大鼠睪丸組織學及PRDM16在睪丸組織中的定位

HE染色顯示，正常組大鼠睪丸生精小管由多層不同發(fā)育階段的生精細胞組成，生精小管排列整齊，管腔內各級生精細胞結構正常，層次清楚，可見大量精子(圖1A、C)；而肥胖組大鼠生精小管排列疏松，間質變寬，睪丸生精上皮結構不完整，生精細胞層數減少，并出現空泡樣改變，管腔內精子數量減少(圖1B、D)。

免疫組織化學染色顯示，鋅指蛋白PRDM16主要表達于大鼠睪丸生精細胞胞質中，且肥胖組大鼠睪丸PRDM16的表達量較正常組明顯減少(圖2)。

A：正常組(×40)；B：肥胖組(×40)；C：正常組(×100)；D：肥胖組(×100)圖1 正常組和肥胖組大鼠睪丸組織(HE染色)

A：正常組；B：肥胖組圖2 正常組和肥胖組大鼠睪丸組織PRDM16表達(免疫組織化學染色 ×100)

四、PRDM16 mRNA在兩組大鼠睪丸、睪周脂肪中的表達

實時熒光定量PCR顯示，肥胖組大鼠睪丸及睪周脂肪組織中PRDM16 mRNA的表達量均顯著低于正常組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖3)。五、PRDM16蛋白在兩組大鼠睪丸及睪周脂肪組織中的表達Western Blot結果發(fā)現，肥胖組大鼠睪丸及睪周脂肪中PRDM16蛋白表達量均顯著低于正常組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖4)。

與正常組比較，*P<0.05圖3 正常組和肥胖組大鼠睪丸及睪周脂肪組織PRDM16 mRNA的表達

討 論

鋅指蛋白是一類通過結合Zn2+自我折疊形成短的穩(wěn)定的“手指”樣結構的蛋白質。鋅指蛋白在基因表達調控、細胞分化和生殖等方面發(fā)揮著重要的作用[6]。PRDM蛋白家族屬于鋅指蛋白家族，其中的鋅指結構域具有識別DNA、RNA和募集組蛋白修飾酶的作用。PRDM蛋白家族屬于Ca2+依賴磷脂結合蛋白，在許多生理和病理性疾病中發(fā)揮著重要的作用[2]。鋅指蛋白PRDM16最早被發(fā)現是在研究白血病的過程中，后發(fā)現廣泛存在于機體多種組織和器官[7]。鋅指蛋白PRDM16可通過催化H3K9mel來維持哺乳動物異染色體的穩(wěn)定性。大量研究證實，PRDM16與脂肪細胞、干細胞的分化密切相關[2，4]。有研究發(fā)現，前列腺癌細胞中PRDM16具有抗凋亡的作用[8]；在造血和神經系統(tǒng)中，PRDM16可影響細胞周期、分化和凋亡，PRDM16基因缺陷的小鼠體內可出現P53蛋白和活性氧(ROS)的表達量增加，維持干細胞功能的基因Hgf mRNA的表達量降低[9-10]，高脂飲食的肥胖大鼠PRDM16基因突變，可使內臟脂肪組織產熱減少，炎性因子基因的表達增加，且出現巨噬細胞聚集[3]。本課題組研究發(fā)現，PRDM16在睪丸各級生精細胞胞質中表達，推測PRDM16可能與精子的生成相關，但有待于進一步的研究。

肥胖是由于過多的脂肪組織在體內蓄積或分布不合理引起的，但是機體內的脂肪組織并非都是有害的。白色脂肪組織通常由白色脂肪細胞聚集而成，可以將體內過多的能量以甘油三酯形式儲存起來；而棕色脂肪組織中含有豐富的線粒體，可以將體內過多的能量通過解偶聯途徑以熱能的形式釋放，具有抵抗肥胖的作用[4，11]。PRDM16不僅為棕色脂肪組織分化的關鍵基因，也是產熱程序啟動的開關基因[12-13]。在含有豐富棕色脂肪組織的嚙齒類動物中，均發(fā)現肥胖動物模型出現棕色脂肪產熱作用的缺陷[14]。本研究發(fā)現，肥胖大鼠睪周脂肪含量明顯高于正常組，而鋅指蛋白PRDM16的表達量卻顯著低于正常組。睪周脂肪屬于內臟白色脂肪，米色脂肪是一類存在于白色脂肪中，但形態(tài)和功能介于白色脂肪和棕色脂肪之間的脂肪。米色脂肪在一定的刺激下，可以發(fā)生類似于棕色脂肪的生化特性和產熱潛能，被稱為“白色脂肪棕色化”，而PRDM16又是白色脂肪棕色化的重要調控因子[15-16]，睪周脂肪中PRDM16的表達量降低，可以抑制白色脂肪棕色化，進一步促進肥胖的發(fā)生。

肥胖對生育力有著負面的影響。本研究成功構建肥胖大鼠模型，通過精液分析發(fā)現：與正常組大鼠相比，肥胖組大鼠精子濃度顯著降低；HE染色發(fā)現，肥胖組大鼠睪丸生精上皮細胞結構不完整，生精小管內出現空泡樣改變，影響精子形成，導致精子濃度降低。本課題組前期研究也發(fā)現，肥胖可影響機體氧化應激水平和精漿中炎性因子含量(待發(fā)表)。過高的活性氧可以損害精子細胞膜，促進精子凋亡；炎性因子改變可影響精子生成的微環(huán)境，從而影響精液質量[17-18]。

綜上所述，肥胖大鼠睪丸及睪周脂肪中PRDM16的表達量、精子濃度和精子活力與正常組相比均顯著降低，鋅指蛋白PRDM16在大鼠睪丸生精細胞胞質中表達，推測其與雄性生殖有關，但有待于進一步的研究證實。