鄭欣洵, 張智靜, 黃寶藝, 廖子君, 劉建軍, 羅 濤

(1. 北京大學深圳醫(yī)院, 深圳518035;2. 深圳市第二人民醫(yī)院, 深圳518035;3. 深圳市疾病預防控制中心, 深圳518000）

過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor, PPAR)是調節(jié)目的基因表達的核內受體轉錄因子超家族成員，通過與目的基因增強子位點中的特異性過氧化物酶體增殖物反應元件結合，參與調控脂質代謝、胰島素敏感性、脂肪酸轉運等作用[1]。PPARγ是PPAR亞型之一，除了在脂肪細胞中表達以外，在免疫細胞，例如單核細胞、巨噬細胞、T細胞以及B細胞均有表達[2,3]。目前研究[4,5]已表明，PPARγ與單核細胞對飲食引起的肥胖、胰島素抵抗和葡萄糖不耐受的敏感性有關。此外，PPARγ可抑制單核細胞的炎癥反應[6,7]并在多種疾病中發(fā)揮抗炎作用[8,9]，而關于單核細胞上PPARγ是具有其它功能及其對應的作用機制尚不明確。

條件性基因敲除(conditional knockout)通過將某種細胞特異性表達cre 重組酶的轉基因小鼠和靶基因鉗制小鼠雜交，得到在該種特定類型的細胞靶基因特異性敲除的轉基因小鼠[10]。由于PPARγ在體內多種細胞上均有表達，因此本課題通過特異性地敲除單核細胞上的PPARγ受體，為進一步研究單核細胞PPARγ受體的功能及其機制提供實驗動物。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

loxp轉基因純合子(PPARγloxp/loxp)小鼠，是在PPARγ基因第1和2外顯子的兩側重組添加loxp 位點。兩loxp 位點間的序列被刪除后將使PPARγ基因發(fā)生移碼突變; 單核細胞特異性表達cre重組酶純合子(Cx3cr1cre/cre)小鼠，是在小鼠基因組插入 cre 酶基因，并且該基因可以通過單核細胞特異性的啟動子在單核細胞表達 cre 重組酶。與loxp 轉基因小鼠雜交，則cre重組酶介導的重組能夠將PPARγ基因序列刪除，這些序列刪除具有細胞特異性，僅在單核細胞中發(fā)生。以上小鼠購自美國JAX實驗室，小鼠引進后在SPF級實驗動物房進行飼養(yǎng)及繁殖 [SYXK(粵)2015-0106]。

1.2 主要實驗試劑

他莫昔芬(美國Sigma公司)，基因組DNA提取純化試劑盒及PCR試劑盒(中國Vazyme公司), 細胞裂解液(中國碧云天公司)，蛋白酶抑制劑(美國MedChemExpress公司), BCA蛋白質定量試劑盒(美國Biosharp公司)，PCR反應引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.3 實驗方法

1.3.1 單核細胞PPARγ條件性基因敲除小鼠的建立將引進的小鼠按1只雄性(PPARγloxp/loxp)小鼠: 2只雌性(Cx3cr1cre/cre)小鼠合籠，得到F1代，飼養(yǎng)至2～3周時采用RT-PCR方法鑒定小鼠基因型。再由F1代小鼠自交, 采用同樣的方法獲取F2代并鑒定其基因型, 篩選出基因型為PPARγloxp/loxpCx3cr1cre/cre以及PPARγloxp/loxpCx3cr1cre/-小鼠, 為實驗所需的PPARγ條件基因敲除小鼠即實驗組(PPARγ-ko)，基因型為PPARγloxp/loxpCx3cr1-/-小鼠為對照組(PPARγ-wt)。

1.3.2 單核細胞PPARγ基因特異性敲除及其鑒定將實驗組小鼠飼養(yǎng)至4～6周齡時，連續(xù)5 d腹腔注射75 mg/kg他莫昔芬，注射結束后3 d內提取小鼠腹腔巨噬細胞。將獲得的腹腔細胞進行培養(yǎng)、分離及純化，用免疫熒光方法鑒定所提取細胞表型，再用Western blotting方法測定實驗組小鼠腹腔巨噬細胞PPARγ蛋白的表達量。

1.3.3 PCR及水平電泳 采用PCR擴增儀(Eppendorf 6347)進行PPARγloxp序列以及Cx3cr1cre序列的循環(huán)擴增。引物序列見表1。采用凝膠成像系統(tǒng)(BIORAD)分析條帶。

1.3.4 免疫熒光 用質量分數4%多聚甲醛固定實驗組小鼠腹腔巨噬細胞，牛白蛋白(BSA)進行封閉后加入Iba1抗體(1∶1000，Wako)進行熒光染色，DAPI封片后用熒光顯微鏡(Olympus)觀察圖片、拍照并保存。

表1 轉基因小鼠PCR引物序列

1.3.5 Western blotting 用細胞裂解液及蛋白酶抑制劑提取實驗組和對照組小鼠腹腔巨噬細胞總蛋白,BCA法測定蛋白濃度后，用Western blotting方法測定小鼠腹腔巨噬細胞PPARγ(1∶1000, Abcam)蛋白的表達水平，用全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(Tanon)拍照并保存。

2 結果

2.1 F1代及F2代小鼠基因型鑒定

圖1是純合子PPARγloxp小鼠(PPARγloxp/loxp)和單核細胞特異性表達cre重組酶的Cx3cr1-cre小鼠(Cx3cr1cre/cre)雜交產生的F1代分別針對PPARγloxp序列(圖1A)和Cx3cr1Cre序列(圖1B)得到的條帶電泳鑒定結果。由圖1A可知, 1～6號小鼠為雜合子, 該小鼠單核細胞PPARγ基因只有一側插入loxp 序列, 基因型為PPARγloxp/-。圖1B結果表明, 1～6號小鼠為雜合子, 基因型為Cx3cr1cre/-。綜合以上結果可知, F1代小鼠均為雜合子, 基因型為 PPARγloxp/-Cx3cr1cre/-。

圖2是F2代分別針對PPARγloxp序列(圖2A)和Cx3cr1Cre序列(圖2B)得到的條帶電泳鑒定結果。從圖2A可知2、4號小鼠為雜合子，該小鼠單核細胞PPARγ基因只有一側插入loxp 序列，基因型為PPARγloxp/-; 3號為野生型(wt)小鼠，該小鼠單核細胞PPARγ基因兩側無loxp序列插入，基因型為PPARγ-/-, 而1、5號小鼠為突變型且純合子，基因型為PPARγloxp/loxp, 為實驗所需的基因型。由圖2B可知1、2號小鼠為雜合子, 基因型為Cx3cr1cre/-，3、4號小鼠為純合子，基因型為Cx3cr1cre/cre，5號為野生型小鼠，基因型為Cx3cr1-/-。結合圖2A及圖2B鑒定結果，1號小鼠基因型為PPARγloxp/loxp Cx3cr1cre/-，是成功構建的單核細胞PPARγ-ko小鼠，5號小鼠基因型為PPARγloxp/loxpCx3cr1-/-是實驗所需的PPARγ-wt小鼠。

2.2 單核細胞PPARγ基因特異性敲除鑒定

圖3A為IBA1標記的腹腔巨噬細胞，圖3B為DPAI標記的細胞核，圖3C為圖3A和圖3B的疊合圖片，從圖可知，所提取的腹腔細胞大部分為IBA1標記的細胞，即為實驗所需的巨噬細胞。

由圖4可知，實驗組小鼠巨噬PPARγ蛋白表達量與對照組小鼠相比明顯降低，證明其巨噬細胞PPARγ基因被特異性敲除。

圖1 F1子代小鼠全組基因型鑒定圖

圖2 F2子代小鼠全組基因型鑒定圖

序號1～6為小鼠編號; 圖1A及圖2A分別為F1子代和F2子代針對PPARγloxp序列擴增得到的電泳結果; 圖1B及圖2B 分別為F1子代和F2子代針對Cx3cr1Cre序列擴增得到的電泳結果

圖3 PPAR γ-ko小鼠腹腔細胞表型鑒定

圖4 PPAR γ-ko小鼠巨噬細胞PPARγ蛋白表達

3 討論

條件性基因敲除主要利用噬菌體的 Cre/loxp系統(tǒng)，使目的基因的表達或缺失發(fā)生在動物發(fā)育的某一階段或某一特定的組織器官，獲得敲除目的基因的條件性基因敲除小鼠。本實驗利用Cre/loxp系統(tǒng)及孟德爾遺傳定律構建PPARγ條件基因敲除小鼠。將引進的進口雄性loxp轉基因純合子(PPARγloxp/loxp)小鼠與雌性單核細胞特異性表達cre重組酶純合子(Cx3cr1cre/cre)小鼠進行雜交, 得到的F1代通過RT-PCR方法鑒定其基因型均為雜合子，基因型為PPARγloxp/-Cx3cr1cre/-(圖1)，該鑒定結果與孟德爾遺傳定律相符。

將得到的F1代進行自交，理論上產生的F2代基因型有以下9種可能: PPARγloxp/loxpCx3cr1cre/cre、PPARγloxp/-Cx3cr1cre/cre、PPARγ-/-Cx3cr1cre/cre、PPARγloxp/loxpCx3cr1cre/-、PPARγloxp/-Cx3cr1cre/-、PPARγ-/-Cx3cr1cre/-、PPARγloxp/loxpCx3cr1-/-、PPARγloxp/-Cx3cr1-/-、PPARγ-/-Cx3cr1-/-。其中基因型為PPARγloxp/loxpCx3cr1cre/cre或者PPARγloxp/loxp Cx3cr1cre/-的小鼠其單核細胞PPARγ基因位點兩側插入了方向相同的重組loxp 序列且表達Cx3cr1基因的細胞插入了cre重組酶基因，在雌激素誘導下激活的cre重組酶可識別loxp序列，特異性敲除PPARγ基因, 因此基因型為PPARγloxp/loxpCx3cr1cre/cre或者PPARγloxp/loxpCx3cr1cre/-的小鼠即為巨噬細胞PPARγ-ko小鼠; 而基因型為PPARγloxp/loxpCx3cr1-/-的小鼠其單核細胞PPARγ基因位點兩側雖然均插入了重組的loxp 序列，但是其表達Cx3cr1基因的細胞并無cre重組酶基因的插入，因為，其體內不存在識別loxp序列的酶，即使雌激素誘導下亦無法敲除PPARγ基因，即為PPARγ-wt小鼠。因此, 由圖2可知，僅有1號小鼠(PPARγloxp/loxpCx3cr1cre/-)是成功構建的單核細胞PPARγ-ko小鼠，而5號小鼠(PPARγloxp/loxpCx3cr1-/-)為PPARγ-wt小鼠。

IBA1是小膠質細胞及巨噬細胞的標記物，在成功構建單核細胞PPARγ-ko小鼠后, 根據以往腹腔巨噬細胞分離及培養(yǎng)方法[11,12], 提取小鼠腹腔巨噬細胞, 利用IBA1對所提取腹腔細胞進行標記證實所提取的腹腔細胞大部分為巨噬細胞(圖3)。同時利用Western blotting法驗證PPARγ-ko小鼠及PPARγ-wt小鼠巨噬細胞PPARγ蛋白表達情況，其結果表明基因型為PPARγloxp/loxpCx3cr1cre/cre或者PPARγloxp/loxp Cx3cr1cre/-的小鼠經他莫昔芬誘導后可特異性敲除小鼠單核細胞PPARγ基因。

基因敲除小鼠是研究基因功能的重要動物模型，通過構建單核細胞PPARγ條件敲除小鼠，就可以在整體動物水平研究PPARγ的作用，進一步地研究單核細胞PPARγ在人體各個臟器相關疾病中發(fā)揮的作用及其主要機制，對臨床上治療和預防相關的疾病提供理論依據。

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