韋 毅, 符明泰, 陽(yáng) 明, 黃衛(wèi)宣, 藍(lán) 嬌, 覃喜軍, 玉 寧

(1.防城港常春生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司, 防城港538038;2. 廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院科研實(shí)驗(yàn)中心, 南寧 530021;3. 南寧維爾凱生物技術(shù)有限公司, 南寧 530021)

食蟹猴(Macaca fascicularis)是獨(dú)具特色與優(yōu)勢(shì)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源, 近年來(lái)已廣泛應(yīng)用于人類疾病發(fā)生機(jī)制、藥理學(xué)以及新藥臨床前安全性評(píng)價(jià)等研究領(lǐng)域中, 是目前國(guó)內(nèi)外使用量最大的非人靈長(zhǎng)類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[1,2]。國(guó)內(nèi)有關(guān)食蟹猴血液、生化等生物學(xué)指標(biāo)及正常值報(bào)道很多, 而有關(guān)正常食蟹猴的免疫功能指標(biāo)的報(bào)道很少。本文對(duì)正常成年雄性食蟹猴的部分免疫功能指標(biāo)進(jìn)行了測(cè)定, 旨在為實(shí)驗(yàn)食蟹猴的應(yīng)用與免疫相關(guān)疾病的動(dòng)物研究提供一些參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

原種引自越南野生食蟹猴, 經(jīng)人工繁育的第3代成年雄性食蟹猴, 共36只, 體質(zhì)量3.5±0.5 kg, 年齡3～5 (3.8±0.8)歲, 廣西壯族自治區(qū)防城港常春生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司提供[SCXK (桂)2013-0004], 所有動(dòng)物均為無(wú)外觀缺陷和行為異常, 并按相關(guān)檢驗(yàn)檢疫標(biāo)準(zhǔn)確認(rèn)為合格的普通級(jí)動(dòng)物。飼養(yǎng)條件: 所有食蟹猴均按照野生動(dòng)物飼養(yǎng)管理技術(shù)規(guī)程(LY/T, 食蟹猴), 分單籠飼養(yǎng)于不銹鋼籠具內(nèi)(籠具規(guī)格90 cm×90 cm×70 cm); 溫度23℃左右; 相對(duì)濕度40%～60%;噪聲≤60 dB; 換氣次數(shù)10次/h; 明暗12 h/12 h(8∶00～20∶00); 每日飼喂猴顆粒飼料3次, 自由飲水, 并輔以清潔水果。適應(yīng)性飼養(yǎng)60 d后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 儀器設(shè)備與試劑

全自動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(日本希森美康公司,XN-21)、日立7600全自動(dòng)化分析儀(日本日立公司)、FACS Calibur 流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)、淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Becton Dickinson 公司)、細(xì)胞因子[γ-干擾素(IFN-γ)、白介素 -2(IL-2)、白介素-5(IL-5)、白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)、白介素-18(IL-18)]檢測(cè)試劑盒(美國(guó)BD公司)、Immage800特定蛋白儀(美國(guó)Beckman Coulter公司)。

1.3 方法

早上在動(dòng)物空腹、清醒狀態(tài)下，通過(guò)籠具配套裝備固定食蟹猴，由專人每周三上午9∶00抽取動(dòng)物后肢大隱靜脈血用于檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

1.3.1 血液學(xué)常規(guī)檢測(cè) 取抗凝血2 mL, 按照全自動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀以及試劑盒操作規(guī)程進(jìn)行以下指標(biāo)測(cè)定: 白細(xì)胞計(jì)數(shù) (WBC)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)(LY)、淋巴細(xì)胞比值 (LY%)、單核細(xì)胞計(jì)數(shù) (MONO)、單核細(xì)胞比例(MONO%)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(NEUT)、中性粒細(xì)胞比例 (NEUT%)。

1.3.2 T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè) 取抗凝血2 mL與CD3-FITC、CD4-P、CD8-APC單克隆熒光抗體混勻, 避光反應(yīng)15 min, 然后加入1×裂解緩沖液, 300×g離心5 min，PBS洗滌細(xì)胞，應(yīng)用FACS Calibur 流式細(xì)胞儀按照CBA法進(jìn)行CD3+ 、CD4+、CD8+細(xì)胞表型檢測(cè)。

1.3.3 細(xì)胞因子檢測(cè) 取血清50 μL, 應(yīng)用FACS Calibur 流式細(xì)胞儀按照CBA法進(jìn)行IFN-γ、白細(xì)胞介素(IL-s)包括IL-6、IL-5、IL-2、IL-10、IL-18等因子檢測(cè)。300 μL 檢測(cè)稀釋液作為陰性質(zhì)控管(0 ng/L)。

1.3.4 免疫球蛋白、補(bǔ)體檢測(cè) 取血清500 μL，應(yīng)用美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特Immage800特定蛋白儀按照免疫散射比濁法對(duì)血清中免疫球蛋白IgG、IgA、IgM及補(bǔ)體C3、C4進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)、分析，結(jié)果以x-±s表示，采用t檢驗(yàn)比較組間差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血液學(xué)指標(biāo)測(cè)定

如表1所示, WBC、LY、MONO絕對(duì)值較為穩(wěn)定, 3次檢測(cè)結(jié)果間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義; 而第3周NEUT絕對(duì)值比第1周、第2周分別下降了15.24%、13.89%(P＜0.05)。

2.2 T淋巴細(xì)胞亞群指標(biāo)測(cè)定

從表2中可以看出，成年食蟹猴T細(xì)胞在淋巴細(xì)胞中所占比例在第2周分別比第1周、第3周高17.86%和12.11% (P＜0.05); Tc在T細(xì)胞中所占的比例則隨檢測(cè)周次呈逐漸上升趨勢(shì)，但上升幅度較小(P＞0.05)。結(jié)果顯示正常成年雄性食蟹猴的T淋巴細(xì)胞亞群測(cè)值較為穩(wěn)定。

表1 食蟹猴血液學(xué)指標(biāo)

2.3 細(xì)胞因子指標(biāo)測(cè)定

如表3所示，IFN-γ、IL-10和IL-18三次檢測(cè)均未檢出; IL-5、IL-6表達(dá)量較低，3次檢測(cè)結(jié)果間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義; 而IL-2表達(dá)量較高，但三次檢測(cè)值間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 免疫球蛋白、補(bǔ)體測(cè)定

正常成年雄性食蟹猴體內(nèi)的IgG呈高表達(dá)，但各相關(guān)抗體蛋白及補(bǔ)體均穩(wěn)定，3次檢測(cè)結(jié)果間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表4)。

表2 食蟹猴血液免疫學(xué)指標(biāo)

3 討論

食蟹猴廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)、藥理學(xué)、毒理學(xué)、藥物安全性評(píng)價(jià)等方面的實(shí)驗(yàn)研究。然而，目前國(guó)內(nèi)關(guān)于實(shí)驗(yàn)用食蟹猴的各種生物學(xué)指標(biāo)仍缺乏一致性的共識(shí)，尤其在免疫功能指標(biāo)檢測(cè)方面更是匱乏[3,4]。為此, 本研究結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室其他科研項(xiàng)目同步進(jìn)行，旨在進(jìn)一步補(bǔ)充完善該領(lǐng)域的實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，并建立本實(shí)驗(yàn)室的相關(guān)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫(kù)。

表3 食蟹猴血液細(xì)胞因子的表達(dá)

表4 食蟹猴免疫球蛋白、補(bǔ)體指標(biāo)

機(jī)體免疫系統(tǒng)是一個(gè)由免疫器官、免疫細(xì)胞及免疫活性因子組成的極其復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，通過(guò)固有性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答兩種作用機(jī)制發(fā)揮免疫功能。其中，機(jī)體的適應(yīng)性免疫狀況可以從體液免疫和細(xì)胞免疫兩個(gè)方面來(lái)衡量，T、B淋巴細(xì)胞分別是細(xì)胞免疫、體液免疫的主要負(fù)責(zé)細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)成年雄性食蟹猴血液學(xué)檢測(cè)結(jié)果與國(guó)內(nèi)有關(guān)報(bào)道基本一致[4]。

通過(guò)測(cè)定D4+ CD8+的比值可以對(duì)機(jī)體細(xì)胞免疫功能進(jìn)行評(píng)價(jià)，其比例的高低與免疫系統(tǒng)損害的程度具有相關(guān)性[5,6]。本次檢測(cè)結(jié)果顯示，成年雄性食蟹猴T/LYM比例為(42.97±14.50～60.83±8.99)%，Th/T為(36.02±10.58～41.66±9.81)%，Tc/T為(49.64±9.23～55.35±8.10)%。其與黃秋香等[3]的研究結(jié)果部分一致。另一方面，負(fù)責(zé)體液免疫的細(xì)胞是B細(xì)胞，其通過(guò)產(chǎn)生特異性抗體而起作用，其中 IgG、IgA、IgM是介導(dǎo)體液免疫的主要效應(yīng)分子，因此抗體水平是反映體液免疫狀態(tài)的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，成年雄性食蟹猴血清中抗體蛋白IgG呈明顯高表達(dá)，與李巖等[4]的報(bào)道有一定差異，IgM的含量測(cè)定值則基本一致。

參與免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子主要有IFN、IL-s、集落刺激因子、腫瘤壞死因子和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子等五大類[7,8]。本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)IFN-γ、IL-6、IL-5、IL-2、IL-10、IL-18等部分因子進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示: 在正常成年雄性食蟹猴中, 未能檢出IFN-γ、IL-10、IL-18; IL-6、IL-5呈低表達(dá); IL-2檢測(cè)結(jié)果顯示其表達(dá)量較高, 為(3.38±1.62～5.54±1.75) ng/L。所有檢測(cè)指標(biāo)表達(dá)均較為穩(wěn)定，3次檢測(cè)值間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 正常成年雄性食蟹猴中可檢出C3、C4補(bǔ)體成分，兩者表達(dá)均較為穩(wěn)定, 3次檢測(cè)值間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本實(shí)驗(yàn)大部分檢測(cè)結(jié)果與文獻(xiàn)[9]基本一致，部分則有一定差異，這可能與動(dòng)物種群、地域、環(huán)境如籠養(yǎng)方式以及實(shí)驗(yàn)檢測(cè)條件等因素的影響有關(guān)。盡管本實(shí)驗(yàn)樣本量較少且未進(jìn)行性別年齡比對(duì)，但檢測(cè)結(jié)果顯示除血液學(xué)部分指標(biāo)有所波動(dòng)之外，其余指標(biāo)多次測(cè)值均無(wú)顯著性差異，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較好、結(jié)果較為可靠，可為食蟹猴免疫疾病模型建立、免疫疾病新藥物臨床前安全評(píng)價(jià)等相關(guān)研究工作提供免疫學(xué)方面的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)參考。

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