賈章志 徐曉陽 趙秀峰

摘 要：梯度濃度棕櫚酸（Palmitate，PA）孵育的C2C12肌管胰島素抵抗模型的建立。研究方法：將分化5天小鼠骨骼肌肌母細(xì)胞的肌管用不同濃度的PA培養(yǎng)液孵育16h后，尋找孵育結(jié)束后培養(yǎng)液中葡萄糖剩余量比對(duì)照組顯著高，胰島素刺激也不能使糖明顯吸收，肌管內(nèi)有明顯脂質(zhì)積累的濃度作為C2C12肌管胰島素抵抗建立的合適濃度。研究結(jié)果：分化5天的C2C12肌管利用0.5mmol/L的棕櫚酸溶液孵育16h，會(huì)致胰島素抵抗的發(fā)生。

關(guān)鍵詞：C2C12 棕櫚酸 胰島素抵抗

中圖分類號(hào)：G80-32 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：2095-2813（2018）05（c）-0001-02

胰島素抵抗（ Insulin Resistance，IR）是指一定量的胰島素與受體結(jié)合后生物效應(yīng)低于正常，表現(xiàn)為外周組織尤其是脂肪、肌肉組織對(duì)葡萄糖的攝取障礙及肝葡萄糖輸出增多[1]。國家衛(wèi)生部統(tǒng)計(jì)顯示我國新增糖尿病患者絕大多數(shù)為2型糖尿病患者。被認(rèn)為是2型糖尿病的發(fā)病基礎(chǔ)的IR，是當(dāng)今影響人身體健康最主要的代謝性疾病。隨著社會(huì)發(fā)展、飲食習(xí)慣的改變，肥胖人群不斷壯大，肥胖和胰島素抵抗的關(guān)系也成為當(dāng)今研究熱點(diǎn)。大量研究表明，血液中高游離脂肪酸與胰島素抵抗的發(fā)生關(guān)系十分密切。高游離脂肪酸較為敏感的影響著胰島素抵抗現(xiàn)象，是其發(fā)生的主要原因之一[2]。

1 研究材料與方法

1.1 研究材料和基本培養(yǎng)方法

小鼠骨骼肌肌母細(xì)胞株（C2C12細(xì)胞）購買于由南方醫(yī)科大學(xué)。細(xì)胞復(fù)蘇：將細(xì)胞從液氮中取出后迅速放入38℃～40℃的水中，快速搖晃使其解凍。解凍后用酒精對(duì)凍存管表面消毒，移入超凈工作臺(tái)，將含有細(xì)胞的凍存液吸出移入到60mm培養(yǎng)皿中，加入增殖培養(yǎng)液后混勻，靜置5min后轉(zhuǎn)移到恒溫培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2+95%空氣，飽和濕度）。4h后更換培養(yǎng)液，此后每隔48h換液一次，及時(shí)觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。細(xì)胞傳代：細(xì)胞傳代的標(biāo)準(zhǔn)是長到培養(yǎng)皿80%面積。抽離廢棄營養(yǎng)液，PBS沖洗，滴入適量胰酶，覆蓋皿底，放置培養(yǎng)箱消化2～3min。顯微鏡下觀察，細(xì)胞形狀由不規(guī)則變?yōu)閳A形，間隙變寬時(shí)，加入含血清的培養(yǎng)液終止消化，輕敲皿底，并適度吹打。顯微鏡下觀察，細(xì)胞脫離皿底時(shí)，將細(xì)胞懸液吸入離心管，離心，棄上清，向離心管中加入培養(yǎng)液，吹打混勻，然后以1∶3的比例種入新的60mm培養(yǎng)皿中，靜置5min后，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞凍存：取狀態(tài)好的細(xì)胞，經(jīng)PBS清洗，胰酶消化，離心后，棄上清，向離心管中加入約1mL細(xì)胞凍存液，混勻，轉(zhuǎn)移到凍存管中，封口膜密封凍存管，經(jīng)4℃（30min）、-20℃（2h）、-80℃（過夜）的順序處理細(xì)胞，最后轉(zhuǎn)移至液氮中長期保存。細(xì)胞分化：細(xì)胞分化的標(biāo)準(zhǔn)是長到培養(yǎng)皿95%面積，換分化培養(yǎng)液。2天換一次培養(yǎng)液，換分化培養(yǎng)液后開始計(jì)算分化天數(shù)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方案

以小鼠骨骼肌肌母細(xì)胞（C2C12）為研究對(duì)象，將分化5天的肌管換1%BSA的低糖無血清培養(yǎng)液12h后分為對(duì)照組、PA0.25組、PA0.5組、PA0.75組、PA1.0組、胰島素組、PA0.25+胰島素組、PA0.5+胰島素組、PA0.75+胰島素組、PA1.0+胰島素組，對(duì)照組和胰島素組換2%BSA無酚紅高糖DMEM，其他組換PA濃度與組名相對(duì)應(yīng)，分別為0.25、0.5、0.75、1.0mmol/L培養(yǎng)液，胰島素組、PA0.25+胰島素組、PA0.5+胰島素組、PA0.75+胰島素組、PA1.0+胰島素組在孵育結(jié)束前30min加入100nmol/L的胰島素。16h后檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中葡萄糖剩余量，MTT法檢測(cè)PA濃度對(duì)肌管活性的影響，尋找PA孵育的安全劑量，油紅O染色確定肌管內(nèi)的脂質(zhì)積累。

1.3 油紅O染色法檢測(cè)肌管內(nèi)脂肪含量

油紅O屬于偶氮染料，具有親脂性，容易對(duì)脂類染色，臨床上常用來對(duì)組織器官內(nèi)的脂肪進(jìn)行染色。本研究利用油紅O染色判定經(jīng)PA孵育16h的肌管是否有脂質(zhì)的積累。

1.4 C2C12肌管MTT增殖毒性測(cè)定

MTT是一種可以接受氫原子的染料，加入細(xì)胞的培養(yǎng)基中，被活細(xì)胞的線粒體琥珀酸脫氫酶還原成不溶于水的深紫色結(jié)晶甲瓚，死細(xì)胞則不可以進(jìn)行這個(gè)反應(yīng)。DMSO可以溶解細(xì)胞中的甲瓚，酶標(biāo)儀在570nm波長附近可測(cè)定溶液中甲瓚濃度，通過測(cè)定就可以判斷活細(xì)胞的數(shù)量和代謝能力。吸光值大小可以反應(yīng)存活細(xì)胞的數(shù)量和其活性。

1.5 C2C12肌管培養(yǎng)液葡萄糖剩余量測(cè)定

葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法檢測(cè)上清液中剩余葡萄糖濃度，酶標(biāo)儀測(cè)得OD值后通過公式計(jì)算得出，普利萊基因技術(shù)提供試劑盒。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理

本研究利用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（s）的方式表示數(shù)據(jù)。各組數(shù)據(jù)間差異的顯著性用單因素方差分析檢驗(yàn)，P<0.05即具有顯著性差異，P<0.01具有極顯著性差異。

2 研究結(jié)果

2.1 PA孵育后C2C12肌管培養(yǎng)液糖剩余量和MTT的變化

經(jīng)過16h的孵育，0.5、0.75、1.0mmol/L的PA培養(yǎng)液處理的肌管與沒有經(jīng)過PA處理的對(duì)照組相比，培養(yǎng)液中剩余葡萄糖量有顯著升高（P<0.01）。PA+胰島素組的葡萄糖剩余量數(shù)據(jù)顯示：胰島素組和PA0.25+胰島素組肌管由于胰島素的作用，葡萄糖剩余量與不加胰島素的對(duì)照組和PA0.25組相比明顯減少（P<0.01）。PA0.5+胰島素組與PA0.5組相比葡萄糖剩余量沒有顯著性差異（P>0.05）。PA0.75組和PA1.0組的肌管經(jīng)過孵育后細(xì)胞活性減弱，與對(duì)照組對(duì)比具有顯著性差異（P<0.01），說明0.75mmol/L、1.0mmol/L的PA培養(yǎng)液孵育16h影響肌管活力。0.5mmol/L的PA培養(yǎng)液對(duì)肌管活性沒有顯著性影響（P>0.05）。

2.2 PA孵育后C2C12肌管脂質(zhì)積累變化

對(duì)比發(fā)現(xiàn)：經(jīng)過0.5mmol/LPA培養(yǎng)液孵育16h的C2C12肌管內(nèi)脂質(zhì)的積累有所增加，說明了PA孵育可以引起肌管內(nèi)脂質(zhì)的積累，從而影響肌管的糖代謝作用。

3 分析與討論

本研究選取C2C12細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，孵育16h，篩選適當(dāng)孵育濃度，在復(fù)制胰島素抵抗模型基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究收縮對(duì)胰島素抵抗的影響。通過梯度濃度PA（0.25、0.5、0.75、1.0mmol/L）培養(yǎng)液和胰島素孵育分化5天的C2C12肌管16h（胰島素在收樣前30min加入一部分PA孵育的肌管培養(yǎng)液中），收樣后檢測(cè)培養(yǎng)液葡萄糖剩余量，計(jì)算出C2C12肌管對(duì)葡萄糖的攝取量，以此來鑒定胰島素抵抗模型是否建立成功。0.7、1.0mmol/L孵育肌管16h，雖然葡萄糖剩余量增加，但MTT結(jié)果顯示此濃度的PA孵育對(duì)肌管活性會(huì)造成影響。濃度為0.5mmol/L的PA培養(yǎng)液孵育肌管16h后，培養(yǎng)液上清的葡萄糖剩余量明顯高于對(duì)照，MTT結(jié)果相對(duì)對(duì)照組沒有顯著性變化，細(xì)胞活性不受影響。加入胰島素孵育組與單純PA組相比葡萄糖剩余量沒有顯著性變化，表明胰島素對(duì)0.5mmol/L的PA培養(yǎng)液孵育16h后的肌管作用減弱，肌管對(duì)胰島素的敏感性降低，產(chǎn)生了胰島素耐受，胰島素抵抗形成。通過對(duì)比我們也發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過油紅O染色后，0.5mmol/L PA培養(yǎng)液孵育過的肌管內(nèi)紅色脂質(zhì)顆粒有所增加，脂質(zhì)積累增加，說明PA孵育可以引起肌管脂質(zhì)積累，從而影響肌管的糖代謝作用。

4 結(jié)語

分化5天的C2C12肌管利用0.5mmol/L的棕櫚酸溶液孵育16h，會(huì)致胰島素抵抗的發(fā)生。

參考文獻(xiàn)

[1] 陳夢(mèng)云，江國榮.胰島素抵抗細(xì)胞模型研究進(jìn)展[J].安徽醫(yī)藥，2012（2）：141-143.

[2] 劉濱，方愛英.2型糖尿病患者胰島素抵抗與血清游離脂肪酸濃度的關(guān)系[J].中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2013（14）：83-84.