楊玥+劉煜

摘要：乙型肝炎表面抗原（Hepatitis B surface antigen，HBsAg）是乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）的包膜蛋白，其含量可以反映病毒活性，常用于臨床相關(guān)疾病的診斷。由于基因整合的原因，HBsAg在大部分HBV相關(guān)疾病中高表達，被認為是重要的靶標。針對此靶點的抗HBsAg抗體已被廣泛應(yīng)用HBV相關(guān)疾病的分子診斷及治療領(lǐng)域。

關(guān)鍵詞：乙型肝炎；抗乙型肝炎表面抗原抗體；病毒活性；應(yīng)用

中圖分類號：R392 文獻標識碼：A 文章編號：1006-1959（2017）14-0028-03

乙型肝炎是由HBV引起的感染性疾病，盡管疫苗能夠成功減少HBV感染的人數(shù)，但仍有超過20億人受到HBV的困擾。持久的HBV感染會引起慢性肝炎，進而誘發(fā)肝硬化和肝癌等高致死性疾病。目前臨床上的治療方法主要是使用干擾素和抗逆轉(zhuǎn)錄試劑，但長期使用并不能徹底清除病毒，獲得較好的臨床受益，反而還會產(chǎn)生耐藥的突變病毒株。因此，研究者需繼續(xù)探索HBV的致病機制以及開發(fā)新的藥物。HBsAg是HBV的包膜蛋白，在病毒附著、侵入肝細胞的過程中發(fā)揮重要的作用；也是宿主體液和細胞免疫反應(yīng)的靶點，可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生長期的保護性免疫，接種疫苗和HBV感染后會產(chǎn)生特異性抗HBsAg抗體。研究者利用抗HBsAg抗體研究HBsAg的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，繪制蛋白的空間構(gòu)象，結(jié)合位點等，用于臨床檢測診斷試劑的開發(fā)以及設(shè)計合成、改構(gòu)針對HBsAg的高效價的特異性親和抗體。

1 抗HBsAg抗體在診斷方面的應(yīng)用

早期診斷是治療成功的關(guān)鍵，精確的診斷試劑對于疾病的發(fā)展控制至關(guān)重要。HBsAg在HBV感染肝細胞后大量分泌，其表達水平可以反映HBV cccDNA的轉(zhuǎn)錄活性，配合反映病毒復(fù)制活性的HBV DNA水平對患者進行診斷。檢測HBsAg的方法大多以抗原抗體特異性反應(yīng)為基礎(chǔ)。

HBsAg診斷試劑誕生于1992年，用于減少輸血時發(fā)生的HBV感染應(yīng)運而生。隨著檢測試劑靈敏度、準確度的不斷發(fā)展，其用途也日益增多，如今常用于臨床檢測HBsAg的水平及變化判斷患者臨床狀態(tài)及治療效果[1]。HBsAg的持續(xù)表達會刺激肝細胞增生，對肝細胞癌（HCC）的形成及發(fā)展起著重要的作用。尤其是在肝硬化的患者中，肝細胞增殖速率的快速升高是導(dǎo)致HCC的危險因素。Chen Y C[2]等發(fā)現(xiàn)HBsAg血清轉(zhuǎn)換的患者有較好的臨床預(yù)后，較少發(fā)展為HCC。因此，監(jiān)測HBsAg的水平變化是必不可少的。

目前臨床上檢測HBsAg的方法是以抗HBsAg抗體捕獲樣本中HBsAg的能力為基礎(chǔ)，利用抗原抗體特異性反應(yīng)的原理形成的，常用ELISA法、時間分辨熒光分析法、化學(xué)發(fā)光免疫分析法等，并且很多已商品化，如雅培Architect系統(tǒng)、羅氏Elecsys系統(tǒng)等。研究者為了提高靈敏度和精確度，不斷尋找新的方法。Alizadeh N等[3]發(fā)明以抗HBsAg抗體為基礎(chǔ)，利用高靈敏度的電化學(xué)免疫傳感器檢測HBsAg的方法。Sangkyu Lee等[4]建立了壓電微懸臂傳感器檢測方法，通過免疫反應(yīng)后將生物信號轉(zhuǎn)化至電信號，檢測HBsAg的精確度可達0.1～100 ng/ml，并且裝備具有小巧、可攜帶、可多通量檢測等優(yōu)點。此外，抗HBsAg抗體本身也可作為臨床指標，如可以通過疫苗接種后檢測血樣中抗體滴度判斷免疫效果，也可與HBsAg水平共同判斷患者狀態(tài)給予更準確的診治方案。由此可見，抗HBsAg抗體是HBV相關(guān)疾病診斷的基礎(chǔ)。

2 抗HBsAg抗體在治療方面的應(yīng)用

抗體由于具有中和作用，固有效應(yīng)、刺激免疫系統(tǒng)等多種功能已成功用于腫瘤、自身免疫等疾病的治療，但很少用于慢性病毒感染。近年來，抗體在獲得性免疫缺陷綜合征、埃博拉等疾病的研究中也嶄露頭角。雖然目前尚未明確其分子機制，但是利用抗體介導(dǎo)的免疫療法可作為治療病毒感染性疾病的候選方法?？贵w通過結(jié)合作用使病毒包膜蛋白失活，阻斷病毒入侵從而抑制感染的傳播；也可以通過固有效應(yīng)功能如抗體依賴的細胞介導(dǎo)的細胞毒性作用（ADCC）、補體裂解、吞噬作用等清除循環(huán)中的病毒、病毒抗原、產(chǎn)病毒細胞等；此外，抗體與病毒的復(fù)合物可以通過Fc段與免疫效應(yīng)細胞作用產(chǎn)生多種固有和獲得性免疫效應(yīng)對抗病毒。更重要的是，臨床上將HBsAg的血清轉(zhuǎn)換作為是抗HBV治愈的關(guān)鍵指標，然而目前的藥物很少能實現(xiàn)這一目標。

2.1中和作用

乙型肝炎人免疫球蛋白（HBIG）是臨床上常用的阻斷HBV感染的被動免疫試劑，通常從自然感染或接受疫苗后產(chǎn)生高效價抗HBsAg抗體的健康人血漿中獲取，經(jīng)低溫乙醇蛋白分離法等生物濃縮工藝制得。HBIG可使人體被動接受高效價抗HBsAg抗體，從而中和、清除血液中游離的的HBV，避免感染的發(fā)生。Tsuge M等[5]發(fā)現(xiàn)HBIG可在人肝嵌合鼠模型中顯著減少HBV DNA的含量，并呈劑量依賴的形式，且在給藥24 h后血清HBsAg的含量便低于檢測限。因此，HBIG可用于治療HBV相關(guān)疾病。但是HBIG作為一種血液制品，由于原材料和質(zhì)量的嚴格控制等原因很難大規(guī)模生產(chǎn)，同時HBIG也有血液制品含有其它傳染性病原體風險的共同的隱患。為了解決這一壁壘，科學(xué)家們希望應(yīng)用雜交瘤和噬菌體庫等技術(shù)生產(chǎn)安全、有效的抗體。

Zhang T Y等發(fā)現(xiàn)靶向HBsAg（GPCK（R）TCT）結(jié)合位點的抗體E6F6比結(jié)合其它表位的抗體對HBV具有更有效、更持久的作用[6]，證實其在動物模型中可以促進HBsAg和病原體的清除、阻止病毒初始感染。Kucinskaite-Kodze I等[7]也篩選出針對同一位點的高親和力的HB1抗體，證實其與抗體E6F6具有相同的活性。Tan W等[8]構(gòu)建的針對HBsAg兩個不同表位的雙特異性抗體C4D2-BsAb，不僅能更好的中和HBV，還可被內(nèi)吞進入肝細胞抑制HBsAg的分泌。研究者對于抗HBsAg抗體的開發(fā)及作用機制的逐漸認識有助于我們更好的了解HBV，更快的研發(fā)出新的有效的抗HBV相關(guān)疾病的藥物及療法。本實驗室也通過雜交瘤方法篩選出具有高親和力的抗HBsAg抗體，經(jīng)體外實驗證實其可以特異性靶向結(jié)合表達HBsAg的肝癌細胞，抑制細胞分泌HBsAg，促進細胞凋亡，具體作用機制有待進一步探索。

2.2靶向作用

腫瘤靶向治療在HER-2過表達的乳腺癌、胃癌等領(lǐng)域都取得了巨大的發(fā)展。HBV相關(guān)疾病如慢性乙型肝炎及其誘導(dǎo)的肝硬化、肝癌患者的基因組中會發(fā)生HBV DNA整合[9]，使HBsAg穩(wěn)定的過表達。因此，HBsAg可作為特異性標記物進行靶向治療。利用抗HBsAg抗體作為運輸工具，通過融合蛋白或化學(xué)偶聯(lián)等方式將一些小分子藥物、多肽、核酸、放射性核素等具有殺傷腫瘤作用或檢測相關(guān)的物質(zhì)遞送至肝細胞癌處發(fā)揮作用，而其中由于單鏈抗體具有分子量小，免疫原性低、表達構(gòu)建方法成熟、組織滲透性好等優(yōu)勢被研究者們廣泛使用。Bo Yan等[10]利用靶向HBsAg的單鏈抗體scFv15作為“子彈頭”攜帶Fdt-HA2-tBid到達HBsAg陽性的HCC細胞中，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤生長。Wen等[11]通過構(gòu)建靶向HBsAg的單鏈抗體與魚精蛋白截短體的融合蛋白，成功遞送SiRNA至HBsAg為陽性的HepG2.2.15細胞中有效抑制 HBV DNA的表達和復(fù)制。這些研究均證實抗HBsAg抗體作為靶向工具治療HBV相關(guān)肝部疾病的潛力。

2.3免疫激活作用

免疫反應(yīng)是宿主清除體內(nèi)細菌、病毒及腫瘤細胞等病原物質(zhì)的重要手段。長期感染HBV患者機體免疫反應(yīng)受到明顯抑制，主要表現(xiàn)為CD4+T細胞、CD8+T細胞數(shù)量明顯下降，Treg細胞數(shù)量明顯升高，且T細胞表面免疫抑制相關(guān)類受體如PD-1、CTLA-4、TIM-3等呈高表達，T細胞功能嚴重喪失[12]。研究表明，HBsAg可以嚴重影響骨髓來源的樹突狀細胞功能，進而抑制T細胞的增殖，降低INF-γ及IL-12等細胞因子的分泌[13]；也可以有效減弱Toll樣受體所介導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)[14]；高水平HBsAg會耗盡HBsAg特異性T細胞反應(yīng)，被認為是慢性乙肝病人產(chǎn)生病毒免疫耐受的一個重要因素。

抗HBsAg抗體可以大幅度減少HBsAg水平，給免疫系統(tǒng)清除病毒提供機會，這是目前其他藥物所不具備的能力。Tharinger H等[15]利用抗HBsAg抗體與HBsAg結(jié)合形成復(fù)合物的能力，可以加快機體外周白細胞對HBsAg的吞噬作用。由于CHB患者與正常人血樣吞噬HBsAg：IC復(fù)合物的能力相當，HBsAg持續(xù)暴露并不會改變CHB患者外周白細胞的吞噬能力，因此可以通過注射外源性抗HBsAg抗體增強吞噬作用。Zhu D等[16]證明循環(huán)中HBsAg的水平和持續(xù)時間是導(dǎo)致免疫耐受的主要原因?？笻BsAg抗體可減少循環(huán)HBsAg的含量，使耐受鼠逐漸恢復(fù)B細胞和CD4+T細胞的反應(yīng)，打破耐受。同時前文提到Zhang T Y等人[6]篩選出靶向HBsAg的抗體E6F6在動物模型中可以調(diào)節(jié)免疫作用，恢復(fù)HBV耐受鼠的抗HBV T細胞響應(yīng)。這些證據(jù)均證實抗HBsAg抗體在恢復(fù)HBV相關(guān)疾病的免疫反應(yīng)方面具有良好的潛力。

3 展望

越來越多的證據(jù)表明HBsAg在HBV相關(guān)疾病中扮演重要的角色，抗HBsAg抗體逐漸受到研究者的重視?？贵w的更新發(fā)展可以使診斷試劑精確及時的確診疾病，輔助用藥方案，為臨床預(yù)后給予參考；可以代替HBIG解決因來源導(dǎo)致的價格昂貴、產(chǎn)品緊俏以及血液制品固有的病原體風險等問題，用于中和HBV，阻斷病毒感染；可以利用抗HBsAg抗體的靶向性遞送小分子、基因、蛋白等藥物，或讓藥物與免疫系統(tǒng)相互作用，增加療效減少副作用。因此，堅信在未來抗HBsAg抗體在HBV相關(guān)肝部疾病的診斷檢測和臨床治療等領(lǐng)域會有更廣泛的應(yīng)用。

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編輯/成森