余 麗 晏愛芬 王朝芳

（保山學院資源環(huán)境學院，云南保山678000）

祖國醫(yī)學認為“藥食同源，食藥兼有”。美味牛肝菌不僅具有一定的營養(yǎng)價值，而且具有較高的藥用價值。牛肝菌最早記載于古文獻《滇南本草》中：氣味微酸、辛，性平。主治清熱解煩，養(yǎng)血和中?，F(xiàn)代文獻《中國藥用真菌》《中國藥用孢子植物》及《秦嶺巴山天然藥物志》中均提到該菌含有的多種生物堿可治腰腿疼痛、手足麻木、盤骨不舒、四肢抽搐以及婦女白帶異常等癥[1-3]。牛肝菌是一類珍稀大型菌根食用真菌，肉厚而細軟、味道鮮美，富含蛋白質、多糖、纖維素、維生素、礦物質、氨基酸等物質，是我國重要的出口野生食用菌[3]。但野生菌受季節(jié)限制，不能常年為人們供應。目前商業(yè)貿(mào)易的美味牛肝菌全部來自于森林中采集的野生資源，世界各國都投入了大量的人力、物力和財力開展對其引種馴化和人工栽培方法的研究，但均沒有獲得子實體[4-5]。因此進行菌絲分離研究，實現(xiàn)人工栽培具有重要研究及應用的價值。研究通過對保山野生美味牛肝菌菌絲的分離培養(yǎng)，以期為美味牛肝菌的人工馴化提供基礎。

圖1 美網(wǎng)柄牛肝菌

1 材料與方法

1.1材料美網(wǎng)柄牛肝菌（Boletus reticulatus）別名白牛肝菌、大腳菇，圖1，購買于保山市場。

1.2培養(yǎng)基①蛋白胨培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨1 g，KH2PO41 g，馬鈴薯200 g，瓊脂20 g，H2O 1000 mL；②玉米粉培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，玉米粉50 g，瓊脂20 g，硫酸鎂 1 g，磷酸氫二鉀 1 g，硫酸鈣 1 g，H2O 1000 mL；③改良PDA：葡萄糖20 g，馬鈴薯200 g，硫酸鎂1.5 g，瓊脂20 g，H2O 1000 mL；④胡蘿卜培養(yǎng)基：馬鈴薯20 g，胡蘿卜20 g，瓊脂20 g，H2O 1000 mL；⑤PDA：葡萄糖 20 g，馬鈴薯 200 g，瓊脂 20 g，H2O 1000 mL；⑥馬鈴薯培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，馬鈴薯200 g，硫酸鎂 1.5 g，KH2PO41 g，酵母膏 2 g，瓊脂20 g，H2O 1000 mL；⑦黃豆粉培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，KH2PO41 g，酵母膏 7 g，黃豆粉 3 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，MnSO4·H2O 0.5 g，瓊脂20 g，H2O 1000 mL。

1.3接種培養(yǎng)材料處理：挑選新鮮、壯實、無蟲害的野生子實體，去掉雜質后放置1～2 h，使菇體失去多余的水分，便于分離成功。

母種分離：用75%的酒精對菇體表面進行消毒。無菌條件下，以組織分離方法進行牛肝菌母種分離。將子實體縱剖為兩半，用解剖刀分別切取野生美味牛肝菌菌柄最下部（接近菌根的地方）、菌柄中部、菌蓋處、菌蓋與菌柄交接處5個部位組織塊分別放于上述5種培養(yǎng)基中，盡可能將組織塊接入較多的斜面培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件為28℃，無光照。4 d后開始觀察記錄，若有污染則及時剔除。

1.4菌絲生長觀察待接種的組織塊長出較多菌絲時用接種針挑取少量菌絲接種到七種培養(yǎng)基中28℃純化培養(yǎng)，每兩天觀察一次，并記錄其生長情況。通過菌落直徑比較、菌絲生長比較，分析不同培養(yǎng)基對菌絲生長的影響。以確定下一步菌絲培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基。

菌絲的純化：選取經(jīng)過純化培養(yǎng)，生長狀況良好的菌絲接種到適合菌絲生長的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每兩天觀察一次，并進行記錄。

1.5菌種鑒定通過菌絲形態(tài)觀察、研磨菌絲組織的氣味對所分離的菌絲進行初步判斷。在此基礎上提取菌絲DNA進行ITS（Internal Transcribed Spacer）鑒定[6-7]，對分離所得美味牛肝菌菌絲進行種屬鑒定。

2 結果與分析

2.1美味牛肝菌菌絲分離情況不同分離培養(yǎng)基的分離結果差別很大，經(jīng)過接種培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)黃豆粉培養(yǎng)基、玉米粉培養(yǎng)基、馬鈴薯培養(yǎng)基較其它培養(yǎng)基更適合組織塊接種培養(yǎng)。培養(yǎng)到第10天可以看到在組織塊表面有菌絲生長，菌絲較短白色；培養(yǎng)到第16天時可以明顯看出菌絲已經(jīng)生長很濃密，而且長勢很好。美味牛肝菌不同部位組織接種培養(yǎng)后菌絲生長狀況見表1、圖2。

表1 美味牛肝菌子實體不同部位組織分離菌絲生長狀況

圖2 不同培養(yǎng)基中美味牛肝菌組織分離菌絲生長狀況（左為培養(yǎng)10 d，右為培養(yǎng)16 d）

圖3 菌絲在不同培養(yǎng)基中的生長狀況（左為培養(yǎng)6 d，右為培養(yǎng)18 d）

2.2菌絲轉接純化挑取組織中生長健壯、顏色潔白的菌絲轉接于新的培養(yǎng)基中進行純化培養(yǎng)。從組織塊上轉接過來的菌絲培養(yǎng)三四天后開始長出菌絲，菌絲生長速度明顯加快。在不同培養(yǎng)基中菌絲生長情況不同，在培養(yǎng)基②、⑤、⑥中菌絲緊緊貼附著培養(yǎng)基生長，菌絲短不易挑??；在培養(yǎng)基⑦中菌絲向上生長，菌絲也較長較粗壯易挑取。在菌絲生長后期會產(chǎn)生黃褐色的水珠狀分泌物，有分泌物產(chǎn)生的培養(yǎng)基即使后期變干了也不會被污染，說明這種褐色分泌物對防止污染有一定作用，原因還有待進一步研究。第一次轉接后美味牛肝菌在不同培養(yǎng)基中菌絲生長情況見表2、圖3。

結果發(fā)現(xiàn)②、⑤、⑥、⑦四種培養(yǎng)基均適合菌絲生長，菌落在②培養(yǎng)基中生長最快，菌落面積最大，但是它的菌絲都附著在培養(yǎng)基表面生長，菌絲短而且不粗壯，從整體看⑦中的菌落雖然小但是菌絲明顯優(yōu)于其他的培養(yǎng)基，對菌絲生長而言是最適合的培養(yǎng)基。

挑取經(jīng)第一次轉接后的菌絲進行第二次轉接，發(fā)現(xiàn)菌絲更容易存活生長也更好，這可能是因為第一次轉接時菌絲從子實體組織塊上取下來，還沒有適應培養(yǎng)基，較難存活。而第二次轉接時由于經(jīng)過組織分離和第一次轉接的馴化，已經(jīng)能較好的適應人工培養(yǎng)基。取菌絲產(chǎn)生的組織進行培養(yǎng)也很容易存活，部分直接生長成組織，部分在組織外部生長出菌絲，菌絲與組織一起生長。如圖4所示（左圖為第二次轉接菌絲生長情況，右圖為生長后期出現(xiàn)組織分化）。

表2 菌絲轉接在不同培養(yǎng)基中的生長狀況

圖4 第二次轉接菌絲在不同培養(yǎng)基中的生長狀況

圖5 菌絲生長和組織分化（培養(yǎng)基⑦）

圖6 Y5樣品和Y1樣品比對結果

為了更好的觀察菌絲的生長，利用培養(yǎng)基⑦在生長面積較大的培養(yǎng)瓶或三角瓶進行菌絲的培養(yǎng)。從菌絲生長情況看，菌絲在生長初期潔白、濃密、粗壯，但生長后期同樣也出現(xiàn)了組織分化，說明菌絲生長到一定程度開始分化（圖5），在菌絲的保存上還需深入研究。

2.3菌絲的鑒定

2.3.1 形態(tài)觀察 對生長良好的菌絲進行顯微觀察，發(fā)現(xiàn)作為擔子菌的擔子結構、鎖狀聯(lián)合結構不是很明顯。在對菌絲組織進行研磨時，散發(fā)出了濃郁牛肝菌香味，可初步判斷該菌絲確為美味牛肝菌菌絲。

2.3.2 分子鑒定 對培養(yǎng)生長良好的美味牛肝菌菌絲進行DNA的提?。ㄟx取了編號為Y1和Y5的兩個樣，其中Y5直接從子實體取樣，Y1是由Y5轉接培養(yǎng)得到的菌絲），進行ITS（Internal Transcribed Spacer）鑒定，利用Basic Local Alignment Search Tool進行BLAST比對，比對結果如圖6。

結果表明，Y1和Y5為同一個種，中文學名為美網(wǎng)柄牛柄菌，拉丁學名Boletus reticulatus Schaeff.中文別名（同物異名）Boletus edulis subsp.reticulatus（Schaeff）Konr，分類地位為傘菌目牛肝菌科牛肝菌屬網(wǎng)柄牛肝菌（美味牛肝菌）。系統(tǒng)樹構建如圖7。

圖7 系統(tǒng)樹構建

3 小結與討論

研究成功分離出美味牛肝菌菌絲，同時在培養(yǎng)基中后期生長已有組織分化。經(jīng)ITS鑒定，結果為：中文學名為美網(wǎng)柄牛柄菌，拉丁學名Boletus reticu?latus Schaeff.中文別名（同物異名）Boletus edulis sub?sp.reticulatus（Schaeff.）Konr，分類地位為傘菌目牛肝菌科牛肝菌屬網(wǎng)柄牛肝菌（美味牛肝菌）。

從表1、表2可以看出，研究所用的幾種培養(yǎng)基中，加入了黃豆粉（⑦）、玉米粉（②）和馬鈴薯汁（⑥）的培養(yǎng)基相對而言更適合應用于美味牛肝菌菌絲的分離和培養(yǎng)，這主要是利用了天然成分黃豆粉、玉米粉和馬鈴薯中豐富的礦物質和維生素；三種培養(yǎng)基相比又以黃豆粉培養(yǎng)基⑦最適合菌絲生長，菌絲向上生長，菌絲粗壯，菌落邊緣整齊圓形；而②和⑥培養(yǎng)基中菌落大，但菌絲生長地并不好，菌絲緊貼著培養(yǎng)基表面生長，菌絲短不易挑取。在⑦和⑥培養(yǎng)基中雖然都加入了酵母膏，但菌絲在⑦中生長要好于⑥。由此可見，在對美味牛肝菌菌絲分離培養(yǎng)中，黃豆粉和酵母膏對菌絲的生長有重要影響。在菌絲生長后期有部分菌絲出現(xiàn)組織分化，取這些組織進行接種培養(yǎng)很容易培養(yǎng)出菌絲，且不易受污染。

就目前對美味牛肝菌菌絲分離培養(yǎng)的研究雖然較多[8-11]，但成功率不高，同時人工馴化工作也十分艱難[12-13]的現(xiàn)狀，研究在菌絲培養(yǎng)過程出現(xiàn)組織分化同時組織培養(yǎng)更易生長的現(xiàn)象，為下一步探討人工培養(yǎng)提供了思路和依據(jù)。