梁晉誼 周敬豪 周健平 譚毅峰 許克勇

（開平健之源保健食品有限公司，廣東開平529321）

靈 芝為 赤芝 Ganoderma lucidum（Leyss.ex.Fr）Karst的子實(shí)體[1]，屬多孔菌科真菌[2]，臨床上可用于輔助化療或放療治療腫瘤，慢性支氣管炎與哮喘，神經(jīng)衰弱失眠，高血脂癥，高血壓病，糖尿病，肝炎，白細(xì)胞減少癥，毒蘑菇中毒等方面治療或輔助治療[3]。靈芝含有多種功效活性成分，其中靈芝多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、降血糖、降血脂、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞[4]等多方面的生理活性，是靈芝中最重要的活性成分之一，為靈芝保健及藥用價(jià)值開發(fā)重要的功效物質(zhì)基礎(chǔ)。

靈芝干燥后多呈近革質(zhì)或木栓質(zhì)至木質(zhì)的結(jié)構(gòu)[5]，子實(shí)體菌絲壁厚粗大，交織纏繞，具有由葡聚糖、幾丁質(zhì)、纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、蛋白質(zhì)等構(gòu)成的四層結(jié)構(gòu)細(xì)胞壁，質(zhì)地堅(jiān)韌，機(jī)械強(qiáng)度高，耐壓、耐溫、耐酸、耐堿，對消化酶也非常穩(wěn)定，里面的多糖等功效物質(zhì)難以充分地被提取利用。目前通過提取方法的改進(jìn)提高靈芝多糖得率的研究及報(bào)道較多，但少有對靈芝提取前預(yù)處理方式進(jìn)行研究的。研究對比了不同預(yù)處理方式，以及最佳預(yù)處理方式結(jié)合不同提取方法對靈芝多糖提取效果的影響，旨在尋找一種最優(yōu)的預(yù)處理方法，為靈芝多糖的提取利用研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 供試靈芝 取自開平健之源保健食品有限公司靈芝基地，烘干處理，經(jīng)中國科學(xué)院微生物研究所鑒定為Ganoderma lucidum靈芝（赤芝），生產(chǎn)批號：160301C。

1.1.2 試劑 葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品，購于中國計(jì)量科學(xué)研究院；復(fù)合纖維素酶（Celluclast），諾維信公司；食用菌水解酶A01、木瓜蛋白酶，廣西南寧龐博生物工程有限公司；磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、五水合硫酸銅、檸檬酸鈉、無水硫酸鈉、氨水、無水乙醇、濃硫酸、苯酚，均為分析純。

1.2儀器設(shè)備木粒粉碎機(jī)，廣東陽山機(jī)械廠；爪式粉碎機(jī)，廣東陽山機(jī)械廠；氣流粉碎機(jī)，昆山強(qiáng)威粉體設(shè)備有限公司；KQ2200DA型數(shù)控超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；P70D20TP-C6（WO）格蘭仕微波爐，廣東格蘭仕微波爐電器制造有限公司；電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；HHS型電熱恒溫水浴鍋，天津市華北實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；RE-5205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D（III）循環(huán)水式多用真空泵，河南省予華儀器有限公司；DZF水式多用型真空干燥箱，上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；TGL-16B高速臺式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；Uvmini-1240紫外可見分光光度計(jì)，津島公司；Waters 1525高效液相色譜儀。

1.3方法

1.3.1 靈芝粗粉碎 用木粒粉碎機(jī)將靈芝干燥子實(shí)體打成粗粒，再用爪式粉碎機(jī)將粗粒粉碎，過10目篩網(wǎng)。

1.3.2 靈芝預(yù)處理及提取 取經(jīng)過粗粉碎的靈芝粉末樣品，分別進(jìn)行以下操作。

1.3.2.1 直接提取 取4份樣品各100 g，分別加入1000 mL水，微沸提取2 h，過濾收集濾液，濾渣同條件再次提取，合并兩次濾液，真空濃縮干燥（溫度：60℃，真空度：-0.090 MPa），得靈芝提取物，計(jì)算粗收率、多糖含量及多糖得率。

1.3.2.2 浸泡預(yù)處理及提取 取4份樣品各100 g，分別加入1000 mL水，攪拌1 min后靜置，常溫浸泡16 h，然后微沸提取2 h，其它處理同上。

1.3.2.3 微波預(yù)處理及提取 取4份樣品各100 g，分別滴加質(zhì)量比15%的乙醇[6]，邊加邊攪拌均勻，然后置于微波爐中設(shè)置中低火處理3 min，取出后加入1000 mL水，微沸提取2 h，其他處理同上。

1.3.2.4 氣流精細(xì)粉碎預(yù)處理及提取 取20 kg樣品投入氣流粉碎機(jī)中進(jìn)行精細(xì)粉碎（進(jìn)料速度3 kg/h，工作壓力0.8 MPa，設(shè)備氣量2 m3/min），過40目篩網(wǎng)，取4份樣品各100 g，加入1000 mL水，微沸提取2 h，其他處理同上。

1.3.3 氣流精細(xì)粉碎預(yù)處理結(jié)合不同方法提取靈芝多糖

1.3.3.1 熱水提取 同1.3.2.4方法。

1.3.3.2 醇提取 取1.3.2.4所得靈芝精粉4份樣品各100 g，根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)所得最優(yōu)條件，分別加入1000 mL 2%乙醇，70℃提取2 h，過濾收集濾液，濾渣同條件再次提取，合并兩次濾液，其他處理同上。

1.3.3.3 堿提取 取1.3.2.4所得靈芝精粉4份樣品各100 g，根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)所得最優(yōu)條件，分別加入1000 mL 1%氨水溶液，微沸提取2 h，過濾收集濾液，濾渣同條件再次提取，合并兩次濾液，其他處理同上。

1.3.3.4 超聲波結(jié)合酶提取 取1.3.2.4所得靈芝精粉4份樣品各100 g，根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)所得最優(yōu)條件，分別加入1000 mL水，同時(shí)加入0.6 g復(fù)合纖維素酶、0.1 g食用菌水解酶A01、0.6 g木瓜蛋白酶，超聲提取1 h，過濾收集濾液，濾渣同條件再次提取，合并兩次濾液，其他處理同上。

1.3.3.5 微波提取 取1.3.2.4所得靈芝精粉4份樣品各100 g，根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)所得最優(yōu)條件，分別加入1000 mL水，置于微波爐中設(shè)置中低火（150 W）提取15 min，過濾收集濾液，濾渣同條件再次提取，合并兩次濾液，其他處理同上。

1.3.4 分析方法

1.3.4.1 粗收率計(jì)算 粗收率（%）=靈芝提取物重量（g）/靈芝投料量（g）×100

1.3.4.2 多糖含量測定 分光光度測定法，以葡聚糖為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[7]。

1.3.4.3 多糖得率計(jì)算 多糖得率（%）=粗收率（%）×多糖含量（%）×100

1.3.4.4 多糖高效液相色譜檢測分析

1.3.4.4.1 高效液相色譜檢測 采用凝膠滲透色譜法對樣品中的多糖進(jìn)行檢測分析。色譜條件：UltrahydrogelTM250 GPC柱，7.8 mmhydrog；流動(dòng)相為純凈水；柱溫：30℃；流速：0.6 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；檢測器：2420蒸發(fā)光散射檢測器。

1.3.4.4.2 樣品溶液制備 精密稱取1 g試樣（靈芝提取物），加水定容至100 mL，搖勻，濾過，準(zhǔn)確吸取濾液5 mL，加入20 mL無水乙醇，醇沉靜置5 min，離心15 min（5000 r/min），去上清，用80%乙醇離心洗滌沉淀物1次，沉淀物定容至5 mL水，作為供試樣品溶液，進(jìn)樣前用0.45 μm水相針式過濾器過濾。

2 結(jié)果與分析

2.1不同預(yù)處理方法對靈芝多糖提取效果的影響由表1可知，直接提取與浸泡預(yù)處理、微波預(yù)處理后提取相比，粗收率、多糖含量、多糖得率的變化均較小，即浸泡預(yù)處理及微波預(yù)處理對靈芝多糖提取效果的影響不明顯，而氣流精細(xì)粉碎預(yù)處理能大幅提高提取物中的靈芝多糖的含量及得率，與直接提取相比，多糖含量提高114%，多糖得率提高104%。

表1 不同預(yù)處理方法對靈芝多糖提取效果的影響

2.2氣流精細(xì)粉碎預(yù)處理結(jié)合不同方法提取靈芝多糖由表2可知，氣流精細(xì)粉碎預(yù)處理結(jié)合堿提取獲得靈芝多糖的效果最佳，與表1的靈芝粗粉碎后直接提取相比，粗收率提高76%，多糖含量提高78%，多糖得率提高215%。氣流精細(xì)粉碎預(yù)處理結(jié)合醇提取、超聲結(jié)合酶提取及微波提取，相對于結(jié)合傳統(tǒng)的熱水提取方法，提取靈芝多糖的效果沒有明顯提高，并且超聲波結(jié)合酶提取甚至導(dǎo)致多糖含量及多糖得率的下降，也可能是處理?xiàng)l件未達(dá)到最優(yōu)效果所致。熱水提取方法對設(shè)備要求不高，條件容易掌握，生產(chǎn)應(yīng)用普及率高，無有機(jī)溶劑回收、產(chǎn)品中殘留及對環(huán)境的污染等問題，超微粉碎預(yù)處理結(jié)合傳統(tǒng)熱水提取方法即能大幅提高靈芝多糖的提取效果，故具有較強(qiáng)的生產(chǎn)實(shí)踐意義。

2.3靈芝多糖液相色譜檢測由圖1可知，氣流精細(xì)粉碎預(yù)處理后熱水提取的多糖物質(zhì)峰型特征（b）與直接提取的（a）比較接近，出峰時(shí)間、各峰面積之間的比例都比較相似，總體峰面積為b＞a。推測氣流精細(xì)粉碎預(yù)處理后熱水提取跟直接提取相比，在提取靈芝多糖的效果方面，主要是在不明顯改變提取所得多糖的種類及互相之間比例的前提下，提高提取物中靈芝多糖的總體含量，從而使靈芝多糖得率提高，使提取更加充分完全。而氣流精細(xì)粉碎預(yù)處理結(jié)合堿提取的多糖特征圖譜（c），與直接提取相比變化較大，出峰的峰型明顯改變，提示提取所得靈芝多糖的性質(zhì)發(fā)生了改變。

表2 氣流精細(xì)粉碎預(yù)處理結(jié)合不同方法提取靈芝多糖

圖1 不同靈芝提取物樣品的多糖液相特征圖譜

3 結(jié)論與討論

（1）對比浸泡、微波、氣流精細(xì)粉碎等預(yù)處理方式對從靈芝子實(shí)體中提取靈芝多糖效果的影響，其中氣流精細(xì)粉碎預(yù)處理能大幅提高靈芝多糖的提取效果，對比靈芝直接提取，粗收率變化較小，而多糖含量提高114%，多糖得率提高104%。

（2）考察氣流精細(xì)粉碎預(yù)處理結(jié)合熱水提取、醇提取、堿提取、超聲波結(jié)合酶提取、微波提取等提取方式在靈芝多糖提取方面的效果，最佳的組合方式為氣流精細(xì)粉碎預(yù)處理結(jié)合堿提取，可使粗收率提高76%，多糖含量提高78%，最終多糖得率提高215%。

（3）通過對不同處理方法所得靈芝提取物的多糖特征圖譜進(jìn)行比較分析，認(rèn)為氣流精細(xì)粉碎預(yù)處理對靈芝多糖提取效果的影響，主要是提高提取物中靈芝多糖的總體含量，從而使多糖得率提高，使提取更加充分，而對所提取多糖的種類及互相之間的比例影響不大。

（4）氣流精細(xì)粉碎預(yù)處理能大幅提高靈芝多糖的提取效果，且對所提取多糖性質(zhì)的影響較小，推測氣流粉碎預(yù)處理主要是破環(huán)了靈芝精粉的機(jī)械支撐壁膜結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞內(nèi)功效物質(zhì)的溶出更加完全，這方面內(nèi)容將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)開展中進(jìn)行研究分析。