楊薇紅，童 斌，張小華，陳 賡，高 強，徐 中

（江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學院生物工程系，江蘇句容212400）

發(fā)芽馬鈴薯PDA培養(yǎng)基對幾種霉菌培養(yǎng)效果的影響

楊薇紅，*童 斌，張小華，陳 賡，高 強，徐 中

（江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學院生物工程系，江蘇句容212400）

選擇特定萌發(fā)階段馬鈴薯制備馬鈴薯PDA培養(yǎng)基，研究其對霉菌的培養(yǎng)效果。通過測定不同芽長馬鈴薯還原糖含量和淀粉酶活性，選擇還原糖含量最高階段馬鈴薯為原料制備馬鈴薯PDA培養(yǎng)基，分別接種黑曲霉、毛霉和青霉，并比較其培養(yǎng)效果。結(jié)果表明，馬鈴薯芽長2 cm時還原糖含量最高，達到37%；淀粉酶活性也達到最高，為5.2 U/mg。發(fā)芽馬鈴薯PDA培養(yǎng)基可以促進霉菌生長加速，菌落覆蓋范圍更大；青霉在培養(yǎng)72 h后出現(xiàn)分泌現(xiàn)象。馬鈴薯發(fā)芽過程還原糖含量和淀粉酶活性升高；發(fā)芽馬鈴薯PDA培養(yǎng)基可以加快霉菌生長速度。

發(fā)芽馬鈴薯；PDA培養(yǎng)基；霉菌；培養(yǎng)效果

馬鈴薯（Solanum tuberosum）屬茄科多年生草本植物，原產(chǎn)于南美洲安第斯山區(qū)，主要生產(chǎn)國有中國、俄羅斯、印度、美國等。馬鈴薯（簡稱PDA）培養(yǎng)基是最常用的真菌類培養(yǎng)基之一，由于馬鈴薯塊莖中含淀粉15%～25%，蛋白質(zhì)2%～3%，脂肪0.7%，粗纖維0.15%，還含有豐富的鈣、磷、鐵、鉀等礦物質(zhì)及VC，VA和B族類維生素，營養(yǎng)豐富，所以常用于食品發(fā)酵類霉菌的培養(yǎng)[1]。對PDA的優(yōu)化和改良研究主要集中于外源物質(zhì)添加、pH值篩選和去皮工藝上[2-4]，休眠破除與發(fā)芽可導致馬鈴薯產(chǎn)生一系列復雜的生理變化。發(fā)芽馬鈴薯PDA培養(yǎng)基對霉菌培養(yǎng)效果的研究至今仍為空白，未見任何報道，開展相關(guān)領(lǐng)域基礎(chǔ)應用研究，對于進一步優(yōu)化PDA培養(yǎng)基配方、降低培養(yǎng)成本和提高培養(yǎng)效果具有極高的實際應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

霉菌（黑曲霉、毛霉和青霉），江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學院微生物實驗室提供；馬鈴薯，購自句容市北門綜合市場；葡萄糖、瓊脂、堿性酒石酸銅溶液、乙酸鋅溶液、亞鐵氰化鉀溶液等試劑，均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

YXQ-LS-50S11型高壓蒸汽滅菌鍋，上海東亞壓力容器制造有限公司產(chǎn)品；LRH-250F型微生物培養(yǎng)箱，上海齊欣科學儀器有限公司產(chǎn)品；DHG-9123A型電熱鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司產(chǎn)品；SW-OJ-2FD型潔凈工作臺，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗處理設計

試驗設計4個處理，分別選取未發(fā)芽、芽長1 cm、芽長2 cm、芽長3 cm馬鈴薯作為PDA培養(yǎng)基原料。在室溫條件下測定發(fā)芽馬鈴薯還原糖含量、淀粉酶活性，重復3次，篩選還原糖含量最高的1組處理與未發(fā)芽組處理（CK）進行PDA培養(yǎng)基霉菌接種培養(yǎng)效果比較。

1.3.2 PDA培養(yǎng)基制備

發(fā)芽和未發(fā)芽馬鈴薯洗凈去皮→各稱取200 g切塊（0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm）→加入適量水煮沸10 min→4層紗布過濾→取濾液加入葡萄糖20 g→瓊脂15 g→攪拌溶解加水至1 000 mL→分裝→1×105Pa滅菌20 min。

1.3.3 霉菌最佳稀釋倍數(shù)的確定

依據(jù)現(xiàn)行最新的霉菌和酵母計數(shù)國家標準GB 4789.15—2010方法操作，分別將黑曲霉、毛霉和青霉菌液進行逐級稀釋，按1∶10，1∶1×102，1∶1× 103，1∶1×104，1∶1×1055個稀釋度等級各吸取1 mL菌液分別加入滅菌的PDA平板中，每個稀釋度作2個平行，置于27～29℃微生物培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d后分別計數(shù)，根據(jù)最終的霉菌生長計數(shù)情況來確定最佳稀釋度菌液進行后續(xù)試驗。

1.3.4 霉菌接種及培養(yǎng)效果觀察

用75%的酒精棉球擦拭雙手→點燃酒精燈→灼燒接種環(huán)→在酒精燈無菌區(qū)（火焰區(qū)10 cm扇形區(qū)域）接種（五點法）黑曲霉、毛霉和青霉→26℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)。在24，48，72 h，分別統(tǒng)計霉菌生長情況，并拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)芽馬鈴薯理化指標的變化

2.1.1 還原糖含量的變化

發(fā)芽馬鈴薯還原糖含量的變化見圖1。

由圖1可知，未發(fā)芽馬鈴薯（CK）還原糖含量處于較低水平，為4%。發(fā)芽啟動后，還原糖含量迅速上升，芽長為1 cm時即達到33%；當芽長為2 cm時達到最大值，為37%；還原糖含量在芽長為3 cm時卻有所下降，為35%。還原糖含量的上述變化，可能與其內(nèi)部發(fā)芽時期糖類物質(zhì)代謝機制有關(guān)。

2.1.2 淀粉酶活性的變化

未發(fā)芽馬鈴薯淀粉酶活性達到2.5 U/mg，發(fā)芽之后，淀粉酶活性也有一個快速上升的趨勢，當芽長為1 cm時，達到3.9 U/mg；芽長2 cm時達到最大值，即5.2 U/mg；當芽長增長到3 cm時，淀粉酶活性不升反降，達到4.9 U/mg。

發(fā)芽馬鈴薯淀粉酶活性的變化見圖2。

圖1 發(fā)芽馬鈴薯還原糖含量的變化

圖2 發(fā)芽馬鈴薯淀粉酶活性的變化

由圖2可知，馬鈴薯發(fā)芽前后其糖類物質(zhì)代謝呈現(xiàn)一定規(guī)律，即不斷上升的淀粉酶活性加劇淀粉的水解速度，使還原糖含量持續(xù)上升；當?shù)矸勖富钚灾练逯岛笙陆?，與之代謝相關(guān)的還原糖含量也呈現(xiàn)一致的變化趨勢。

2.2 發(fā)芽馬鈴薯PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)霉菌的效果

2.2.1 培養(yǎng)黑曲霉的效果

黑曲霉在不同PDA培養(yǎng)基上的生長情況見表1。

表1 黑曲霉在不同PDA培養(yǎng)基上的生長情況

由表1可知，黑曲霉接種在發(fā)芽馬鈴薯PDA培養(yǎng)基上，菌落生長明顯快于對照，菌絲生長速度達到0.65 cm/d，而CK僅為0.44 cm/d。經(jīng)過72 h的培養(yǎng)，發(fā)芽馬鈴薯PDA培養(yǎng)基上菌落范圍覆蓋更大，菌絲密度也更大。

72 h黑曲霉培養(yǎng)效果見圖3。

2.2.2 培養(yǎng)毛霉的效果

毛霉在不同PDA培養(yǎng)基上的生長情況見表2。

由表2可知，毛霉在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)生長速度較為緩慢，72 h后菌絲才萌發(fā)，發(fā)芽馬鈴薯PDA培養(yǎng)基與CK培養(yǎng)效果接近。但是，72 h培養(yǎng)后，其生長明顯加快，發(fā)芽馬鈴薯PDA培養(yǎng)基上菌絲生長速度達到0.60 cm/d，而CK為0.35 cm/d，菌落覆蓋范圍與菌絲密度也顯著高于CK。

72 h毛霉培養(yǎng)效果見圖4。

圖3 72h黑曲霉培養(yǎng)效果

表2 毛霉在不同PDA培養(yǎng)基上的生長情況

圖4 72h毛霉培養(yǎng)效果

2.2.3 培養(yǎng)青霉的效果

青霉在不同PDA培養(yǎng)基上的生長情況見表3，不同時間培養(yǎng)青霉的效果見圖5，青霉在發(fā)芽馬鈴薯PDA上培養(yǎng)72 h的分泌現(xiàn)象見圖6。

表3 青霉在不同PDA培養(yǎng)基上的生長情況

由表3可知，發(fā)芽馬鈴薯PDA培養(yǎng)基和CK上接種的青霉均在48 h開始萌發(fā)菌絲，兩者菌絲生長速度接近，分別為0.32 cm/d和0.30 cm/d；菌絲密度也較為一致，均表現(xiàn)為菌絲稀疏。在2種培養(yǎng)基上青霉都表現(xiàn)出彌漫狀生長。

由圖5可知，發(fā)芽馬鈴薯PDA培養(yǎng)基上接種的青霉菌落覆蓋范圍較CK更大，但其菌絲密度與CK差異并不明顯。培養(yǎng)72 h后，發(fā)芽馬鈴薯PDA上的青霉菌落有分泌現(xiàn)象，而CK并未發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象，培養(yǎng)基中發(fā)芽馬鈴薯內(nèi)含物變化有可能是引起此分泌現(xiàn)象的原因。

圖5 不同時間培養(yǎng)青霉的效果

圖6 青霉在發(fā)芽馬鈴薯PDA上培養(yǎng)72 h的分泌現(xiàn)象

3 結(jié)論與討論

馬鈴薯自然休眠與萌發(fā)，是受多因素影響的生理現(xiàn)象?？刀涮m[5]在研究中發(fā)現(xiàn)，萌發(fā)過程中馬鈴薯淀粉含量逐漸下降，可溶性糖含量逐步上升，在收獲后40 d時出現(xiàn)高峰，淀粉酶、淀粉磷酸化酶活性分別在收獲后40 d和50 d時上升，而多酚氧化酶活性則在收獲后50 d時降低。研究結(jié)果表明，馬鈴薯萌發(fā)后還原糖含量與淀粉酶活性也呈現(xiàn)一致的變化趨勢，說明馬鈴薯萌發(fā)過程中，大分子的淀粉類物質(zhì)被水解為小分子物質(zhì)，如可溶性糖等，相關(guān)酶類的活性也隨之發(fā)生變化，加速淀粉的水解速度。這些萌發(fā)中產(chǎn)生的小分子物質(zhì)在微生物培養(yǎng)基內(nèi)成為霉菌生長發(fā)育的有效底物，從而使其加快生長速度。

在發(fā)芽馬鈴薯PDA培養(yǎng)基上，與CK相比，黑曲霉、毛霉和青霉表現(xiàn)出類似的培養(yǎng)效果，即菌落生長速度加快，覆蓋面增加，僅青霉的菌落密度與CK差異不大，說明發(fā)芽馬鈴薯所制作的PDA培養(yǎng)基的確存在促進霉菌加速生長的某些物質(zhì)或某種機制，具體是哪些物質(zhì)或何種機制，仍需開展大量細致的深入研究。另外，青霉在培養(yǎng)72 h后出現(xiàn)明顯的分泌現(xiàn)象，分泌物的定性鑒定也需要作進一步研究。

郭杉杉等人[6]研究發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯皮制作食用菌母種培養(yǎng)基對多種食用菌培養(yǎng)具有一定促進作用，其研究結(jié)論與試驗結(jié)果有無關(guān)聯(lián)仍需進一步研究確認。

試驗首次開展發(fā)芽馬鈴薯PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)霉菌效果的研究，為開發(fā)和完善更為有效的馬鈴薯PDA培養(yǎng)基奠定理論基礎(chǔ)與數(shù)據(jù)，對于降低微生物培養(yǎng)成本、提高微生物培養(yǎng)效果、加強相關(guān)產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有較高應用價值。

[1]楊勇，張鳳英，陳岑．PDA培養(yǎng)基改良配方的研究[J]．釀酒科技，2012（4）：29-31．

[2]顏松．PDA培養(yǎng)基的改良在霉菌計數(shù)中的應用研究[J]．農(nóng)產(chǎn)品加工（學刊），2013（7）：18-20．

[3]戴肖東，張不奇，馬慶芳．PDA培養(yǎng)基滅菌前后pH值的變化及對黑木耳菌絲生長的影響[J].食用菌，2008（6）：30-31．

[4]李云波，王新濤．配制PDA培養(yǎng)基中馬鈴薯去皮問題的探討[J]．食用菌，1994（6）：19．

[5]康朵蘭．馬鈴薯大西洋塊莖在休眠萌發(fā)和低溫貯藏期的生理生化變化[D]．長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學，2007．

[6]郭杉杉，王相剛，李艷芳.馬鈴薯皮在食用菌母種培養(yǎng)基中的應用[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學，2015（3）：125-127.◇

Influence on Culture Effect of Several Moulds of Germination of Potato PDA Medium

YANG Weihong，*TONG Bin，ZHANG Xiaohua，CHEN Geng，GAO Qiang，XU Zhong
（Department of Biological Engineering，Jiangsu Polytechnic College of Agriculture and Frestry，Jurong，Jiangsu 212400，China）

Selecting the specific germination stage of potato to production of PDA culture medium，and study the effect of the culture of the moulds in above PDA culture medium.The content of reducing sugar and the amylase activity of different shoot length of germination potato are determined.Select the highest stage of reducing sugar content of potatoes as a raw material for preparing potato PDA medium，are inoculated with Aspergillus niger，Hairy mould and Blue mould，and compare their culture effect with CK.The highest reducing sugar content of potato with shoot length 2 cm is 37%，and the amylase activity is the highest，which is 5.2 U/mg.Germination of potato PDA culture medium can accelerate the growth of mold，the mould colony covering a larger than CK.The secretion phenomenon of Blue mould in germination potato PDA after 72 h culture appeared.The reducing sugar content and amylase activity of germination potato are increased，and the growth rate of mould could be accelerated with the germination potato PDA culture.

germination potato；PDA culture medium；mould；culture effect

S532

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.03.007

1671-9646（2017）03a-0022-03

2017-03-05

江蘇省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（201513103017Y）。

楊薇紅（1968—），女，碩士，實驗師，研究方向為食品微生物檢驗技術(shù)的教學與科研。

*通訊作者：童斌（1968—），男，博士，副教授，研究方向為食品技術(shù)與質(zhì)量控制的教學與科研。