侯冠彧+周漢林+王東勁

摘 要 利用30個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)烏珠穆沁羊、蘇尼特羊、內(nèi)蒙古細(xì)毛羊、寧夏灘羊、小尾寒羊和無角多賽特羊6個(gè)綿羊品種共237個(gè)體進(jìn)行遺傳多樣性分析表明： 6個(gè)綿羊品種平均期望基因多樣度為0.671 1、觀察基因多樣度為0.565 9、平均多態(tài)信息含量為0.596 1； 6個(gè)綿羊品種間遺傳分化系數(shù)為11.74 %；系統(tǒng)發(fā)生樹將 6個(gè)綿羊品種劃為4個(gè)分支，即蘇尼特羊和烏珠穆沁羊、內(nèi)蒙古細(xì)毛羊和小尾寒羊、寧夏灘羊、無角多賽特羊。

關(guān)鍵詞 綿羊 ；微衛(wèi)星DNA ；遺傳多樣性

中圖分類號(hào) S826

Abstract To analyze the genetic diversity through 30 microsatellite loci in Ujumqin （WU） sheep； Sonid （SU） sheep； Inner Mongolia Wool （NE） sheep； Tan （TA） sheep ； Small-Tail Han （XH）sheep and Poll Dorset （PD） sheep breed， the results showed that he expected and observed mean gene diversities were 0.6711 and 0.5659， the mean polymorphism value were 0.5961， gene differentiation are 11.74% in all sheep breeds. The 6 sheep breeds can be sorted with four cluster： Sonid （SU） and Ujumqin （WU） sheep， Small-Tail Han （XI） and Inner Mongolia Wool （NE） sheep， Tan （TA） sheep of Ningxia， Poll Dorset sheep.

Key words sheep ；microsatellite DNA ；genetic diversity

遺傳多樣性研究是畜禽品種保護(hù)和利用的基礎(chǔ)性工作，中國(guó)綿羊品種在經(jīng)歷了長(zhǎng)期的自然選擇和人工選擇后，大部分綿羊品種遺傳多樣性水平都發(fā)生了一定程度的改變，有的品種甚至滅絕。20世紀(jì)80年代初完成的全國(guó)畜禽遺傳資源普查，列入中國(guó)羊品種志的有35個(gè)，其中地方品種15個(gè)，棗北大尾羊消失。1999年不完全調(diào)查表明，蘭州大尾羊受到嚴(yán)重威脅，漢中綿羊、青海黑藏羊受較大威脅[1]。2000年農(nóng)業(yè)部列出的78個(gè)國(guó)家級(jí)畜禽保護(hù)品種名錄中，小尾寒羊、烏珠穆沁羊、寧夏灘羊、同羊、西藏羊、貴德黑裘皮羊、湖羊都在其中。因此，針對(duì)中國(guó)綿羊品種進(jìn)行遺傳多樣性分析則具有一定實(shí)際意義。

微衛(wèi)星DNA是短的串聯(lián)的簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Simple Sequence Repeat簡(jiǎn)稱SSR），廣泛分布于生物體的整個(gè)基因組。具有數(shù)量多、多態(tài)性豐富、保守性強(qiáng)、共顯性遺傳、進(jìn)化承受選擇壓力小，操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好和檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是品種遺傳變異、結(jié)構(gòu)估測(cè)和演化歷史分析最主要的分子標(biāo)記之一[2-4]。筆者借助微衛(wèi)星DNA分析，評(píng)估中中國(guó)部分地方綿羊品種的遺傳變異和群體結(jié)構(gòu)情況，為制定地方綿羊品種的保護(hù)和利用策略提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本采集

采取典型群隨機(jī)抽樣和品種內(nèi)亞群定點(diǎn)隨機(jī)抽樣法采集了無親緣關(guān)系的6個(gè)綿羊品種共237個(gè)體的耳組織樣[5]（表1）。

1.1.2 微衛(wèi)星引物

微衛(wèi)星DNA引物由網(wǎng)站（http：//www.marc.usda.gov）查得，選擇彼此不連鎖，遍布大部分染色體的30個(gè)位點(diǎn)（表2）。引物由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取

DNA提取參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》（第2版）[6]哺乳動(dòng)物細(xì)胞中分離高分子量DNA的方法。

1.2.2 PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)采用12 μL反應(yīng)體系，每個(gè)反應(yīng)含有0.2 mmol·L-1 dNTPs，每條引物6 pmol，1 U Taq酶，模板DNA約50 ng，Mg2+濃度1.5 mmol·L-1。本實(shí)驗(yàn)PCR反應(yīng)條件和程序，95預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，50-60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，經(jīng)33-35個(gè)循環(huán)，于72 ℃延伸5-10 min。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

1.3.1 群體內(nèi)遺傳變異

應(yīng)用GDA（gene data analysis）軟件分析。

（1）平均基因多樣度（Average gene diversity）表示群體平均在某微衛(wèi)星座位為雜合子的比例。參數(shù)D為各個(gè)位點(diǎn)的平均基因多樣度，括號(hào)中為基因多樣度。D由下式計(jì)算：

（2）多態(tài)信息含量（polymorphism information content，PIC）是位點(diǎn)多態(tài)性高低的一個(gè)度量。

1.3.2 群體間的遺傳關(guān)系

應(yīng)用DISPAN軟件分析

（1）遺傳分化系數(shù)（Coefficient of gene differentiation，GST），視所有研究群體為一個(gè)群體，計(jì)算群體間的遺傳分化程度。

GST=（DT-DS）/DT

式中DT（Total gene diversity）為總?cè)后w基因多樣度，DS（Average diversity within each population）為亞群體基因多樣度。

（2）遺傳距離，Nei氏標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離[7]，Nei′s遺傳同一性（I）：

其中 和 分別是群體1和2的L基因座u等位基因的估計(jì)頻率。

Nei′s遺傳距離（DS）：

DS=-ln（I）

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA的PCR擴(kuò)增

不同引物擴(kuò)增結(jié)果不同。部分電泳圖見圖1。

2.2 群體內(nèi)遺傳變異

2.2.1 等位基因頻率

等位基因頻率是估計(jì)和比較遺傳多樣性及計(jì)算遺傳距離的最基本數(shù)據(jù)。本實(shí)驗(yàn)用于群體分析的30個(gè)位點(diǎn)在測(cè)定的6個(gè)品種中表現(xiàn)出較為良好的多態(tài)性，總共檢測(cè)到284個(gè)等位基因。30個(gè)位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)的等位基因數(shù)有83 %比報(bào)道的少。等位基因分布不均，等位基因最多者為AGLA269，有19個(gè)等位基因；最少的是ILSTS021，有4個(gè)等位基因。

2.2.2 基因多樣度與多態(tài)信息含量

根據(jù)等位基因頻率，利用GDA程序計(jì)算了6個(gè)綿羊品種的期望基因多樣度和觀察基因多樣度，利用自編程序計(jì)算了6個(gè)綿羊品種的平均多態(tài)信息含量（表3）。由表3可知，內(nèi)蒙古細(xì)毛羊的基因多樣度為0.646 5，最高接近期望基因多樣度0.676 6，品種志記載內(nèi)蒙古細(xì)毛羊是以蒙古羊?yàn)槟副?，蘇聯(lián)美利奴羊、高加索羊、新疆細(xì)毛羊和德國(guó)美利奴羊等品種為父本培育而成。因?yàn)殡s交的結(jié)果使基因趨于雜合，其品種形成是幾個(gè)品種雜交選育的結(jié)果，所以基因多樣度相對(duì)較高。寧夏灘羊的基因多樣度最小為0.483 3與期望基因多樣度0.695 3相差最大，這可能與毛紡織業(yè)的衰落有關(guān)，灘羊受市場(chǎng)影響，由原來養(yǎng)殖高峰的500萬只銳減至100萬只。這在一定程度上影響了灘羊的遺傳多樣性水平。6個(gè)品種平均基因多樣度0.565 9和期望基因多樣度0.671 1相差0.105 2，說明這六個(gè)品種都較原始品種遺傳多樣性有所降低。烏珠穆沁羊的多態(tài)信息含量最高為0.649 1，說明所檢測(cè)位點(diǎn)在烏珠穆沁羊的變異程度較大。因?yàn)踔槟虑哐蜷L(zhǎng)期處在氣候惡劣粗放的狀態(tài)下繁殖，造就了它獨(dú)特的種質(zhì)特性。

2.3 群體間遺傳分化

2.3.1 遺傳分化系數(shù)

根據(jù)等位基因頻率，利用DISPAN程序計(jì)算了6個(gè)綿羊品種在30個(gè)位點(diǎn)的遺傳分化程度（表4）。品種內(nèi)遺傳變異分析表明，6個(gè)綿羊品種的基因多樣度和多態(tài)信息含量比較相近，位點(diǎn)值基本在0.5以上，總?cè)后w基因多樣度為0.634 8。說明6個(gè)綿羊品種遺傳變異相對(duì)比較豐富，選擇潛力較大。這與鞏元芳等[8]利用RAPD標(biāo)記分析蒙古羊、湖羊、灘羊、小尾寒羊、烏珠穆沁羊、無角多賽特等綿羊品種得出的遺傳多樣性水平比較吻合。多年來的引種雜交表明，任何品種在內(nèi)蒙古特有的環(huán)境下，其生長(zhǎng)發(fā)育都受到嚴(yán)重的限制。蒙古羊靠自身整體優(yōu)勢(shì)阻止了外來品種基因入侵，蒙古羊在蒙古高原上的主導(dǎo)地位，是任何其它品種都不可替代的[9]。無角多賽特PIC最低，為0.518 9，屬于中度多態(tài)。因?yàn)閲?guó)內(nèi)的無角多賽特大部分都是人工授精的產(chǎn)物，是少數(shù)種公羊的后代，所以在微衛(wèi)星位點(diǎn)上表現(xiàn)出來的差異也較小。群體間遺傳變異分析表明：6個(gè)品種總?cè)后w的平均值是11.74 %，說明6個(gè)綿羊品種在30個(gè)微衛(wèi)星座位上的分化程度平均為11.74 %，品種間變異占總?cè)后w變異的11.74 %，大部分變異存在于品種內(nèi)部。BM315位點(diǎn)的GST值最大為0.233 1，說明該位點(diǎn)在6個(gè)綿羊品種間的變異程度最大。

2.3.2 群體間遺傳距離和系統(tǒng)發(fā)生樹

基于等位基因頻率計(jì)算了6個(gè)綿羊品種間的Nei位置標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離（表5），并進(jìn)一步進(jìn)行了6綿羊品種的NJ法和UPGMA法聚類（圖2）。結(jié)果表明：系統(tǒng)發(fā)生樹中烏珠穆沁羊和蘇尼特羊是蒙古羊分化最晚的2只。由于2個(gè)品種地理位置、氣候條件、飼養(yǎng)方式等都比較接近，受人文環(huán)境影響又很類似，加上有些類群長(zhǎng)期的無目的雜交育種，最后導(dǎo)致2個(gè)群體的同質(zhì)性增加，遺傳距離減小。2個(gè)品種的bootstrap百分?jǐn)?shù)為99以上，說明聚類結(jié)果比較可靠。小尾寒羊和內(nèi)蒙古細(xì)毛羊的遺傳距離為0.362 3，二者在系統(tǒng)發(fā)生樹中聚在一起，因?yàn)?個(gè)品種都和蒙古羊有一定的淵源，它們?cè)谝欢ǔ潭壬隙歼€繼承著蒙古羊的血統(tǒng)。20世紀(jì)90年代以來，隨著毛紡織業(yè)的冷落，內(nèi)蒙古細(xì)毛羊部分一度向肉用方向發(fā)展，在這期間小尾寒羊起到了終端父本作用。小尾寒羊與寧夏灘羊遺傳距離為0.479 6，除了無角多賽特之外，相較其它3個(gè)品種遺傳距離是最大的，這與曹頂國(guó)等[10]利用RAPD標(biāo)記分析小尾寒羊和灘羊的親緣關(guān)系結(jié)果比較一致。寧夏灘羊以生產(chǎn)二毛皮而著稱，在遺傳距離檢測(cè)中，灘羊和烏珠穆沁羊、蘇尼特羊、小尾寒羊及內(nèi)蒙古細(xì)毛羊的距離都比較靠近，但在系統(tǒng)發(fā)生樹中，它始終都是獨(dú)樹一幟，說明寧夏灘羊在大蒙古羊體系下同時(shí)具備自己獨(dú)特的種質(zhì)特性。無角多賽特是一個(gè)引入的肉羊品種，與同屬蒙古羊體系的5個(gè)綿羊品種分為2支，這與多賽特本身遺傳特性、生存地域及引入時(shí)間等有很大的關(guān)系。

3 討論與結(jié)論

平均基因多樣度是兩個(gè)隨機(jī)選出的基因不相同概率，是生物進(jìn)化的基礎(chǔ)。一個(gè)沒有進(jìn)行過人工選擇的群體平均基因多樣度越高，則該群體就越接近于一個(gè)平衡的自然群體；培育品種基因多樣度越高，說明參與引血雜交的品種越多。多態(tài)信息含量是等位基因頻率和等位基因數(shù)變化的函數(shù)，是位點(diǎn)變異程度的一個(gè)描述。平均基因多樣度和多態(tài)信息含量數(shù)值越大，說明群體內(nèi)基因一致性越差，變異性越大，選擇的潛力也越大。

根據(jù)《中國(guó)羊品種志》記載，烏珠穆沁羊產(chǎn)于內(nèi)蒙古錫林郭勒盟東部的烏珠穆沁草原。南宋洪皓著《松漠記聞》中有關(guān)羊描述，生韃靼者，大如驢。尾巨而厚類扇，自脊至尾或重2.5 kg。書中描述的綿羊外形特征與今烏珠穆沁羊基本相似。蘇尼特羊產(chǎn)于內(nèi)蒙古蘇尼特左、右旗境內(nèi)的蘇尼特草原，1997年內(nèi)蒙古自治區(qū)人民政府正式命名，和烏珠穆沁羊同屬肉脂粗毛羊品種。小尾寒羊?qū)俣讨惭?，是由帶入中原的蒙古羊培育而成。?jù)河北《完縣新志》記載，綿羊一種以綏遠(yuǎn)二十家子所產(chǎn)為最良，縣人多赴此地購(gòu)買。有大尾、小尾、黑頭、白頭數(shù)種。大尾者為本地產(chǎn)，小尾者為綏遠(yuǎn)產(chǎn)。內(nèi)蒙古細(xì)毛羊是1960-1967年以蒙古羊?yàn)槟副荆K聯(lián)美利奴羊、高加索羊、新疆細(xì)毛羊和德國(guó)美利奴羊等品種為父本培育而成，1976年經(jīng)內(nèi)蒙古自治區(qū)批準(zhǔn)為新品種。灘羊?qū)亵闷ぱ蚱贩N，是分布在寧夏的蒙古羊經(jīng)過長(zhǎng)期的自然選擇和人工選擇形成的著名二毛裘皮羊品種。清乾隆20年《銀川小志》記載，寧夏各州，俱產(chǎn)羊皮，靈州出長(zhǎng)毛麥穟，狐皮亦隨處多產(chǎn)。長(zhǎng)毛麥穟是人們對(duì)灘羊花穗的形象稱呼。無角多賽特是澳大利亞于50年代通過有角多賽特導(dǎo)入雷蘭、考力代，經(jīng)系統(tǒng)選育形成，屬短毛肉羊品種。本研究的樣本是“八五”期間中國(guó)農(nóng)科院畜牧所由澳大利亞引進(jìn)[11]。通過進(jìn)一步從分子水平驗(yàn)證并補(bǔ)充了品種志對(duì)以上6個(gè)品種的劃分，為綿羊遺傳資源的開發(fā)利用和保護(hù)提供了科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] 馬月輝，陳幼春，馮維祺. 中國(guó)家養(yǎng)動(dòng)物多樣性概況[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2000，31（5）：394-399.

[2] Takezaki N，Nei M. Genetic distance and reconstruction of phylogenetic trees from Microsatellite DNA[J]. Genetics，1996，144（1）：389-399.

[3] Barker J S F. A global protocol for determining genetic distances among domestic livestock breeds[J]. World Congress on Genetics Applied to Livestock Production，1994，21：501-508.

[4] Tautz D. Hypervariability of simple sequences as general source for polymorphic DNA markers[J]. Nucleic Acids Res， 1989， 17（16）：6 463-6 467.

[5] 陳幼春，曹紅鶴. 品種內(nèi)亞群定點(diǎn)隨機(jī)抽樣法的應(yīng)用研究[J]. 黃牛雜志，2001，27（1）：1-3.

[6] J·薩姆布魯克，E·F·弗里奇，T·曼妮阿蒂斯. 分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（第2版）[M]. 北京：科學(xué)出版社，1999.

[7] Nei， M. Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals[J]. Genetics，1978，89：583-590.

[8] 鞏元芳，李祥龍，劉錚鑄，等. 我國(guó)主要地方綿羊品種隨機(jī)擴(kuò)增DNA研究[J]. 遺傳，2002，24（4）：423-426.

[9] 張立嶺.蒙古羊目前存在的問題與進(jìn)一步研究的內(nèi)容[J]. 中國(guó)草食動(dòng)物，2001，3（2）：38-40.

[10] 曹頂國(guó)，杜立新，李淑青. 4個(gè)綿羊品種隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA分析[J]. 中國(guó)畜牧雜志， 2002，38（2）：12-15.

[11] 鄭丕留，涂友仁，蔣 英，等. 中國(guó)羊品種志[J]. 上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1988：65-66.