國　明,　于　峰,　賈科玲,　李　姣,　孫　海

(浙江省化工研究院, 浙江 杭州 310023)

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研究論文

磁性固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定環(huán)境水樣中的四環(huán)素類抗生素

國明,于峰*,賈科玲,李姣,孫海

(浙江省化工研究院, 浙江 杭州 310023)

摘要:建立了磁性固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測定環(huán)境水樣中四環(huán)素類抗生素的方法。以6種四環(huán)素類抗生素(差向四環(huán)素、土霉素、四環(huán)素、去甲金霉素、金霉素和脫水四環(huán)素)為目標(biāo)化合物,考察并優(yōu)化了吸附和解吸條件,確定了最佳萃取條件。萃取后的目標(biāo)化合物經(jīng)ZORBAX Eclipse Plus C(18)柱分離,用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜在多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式下進(jìn)行檢測。在優(yōu)化的條件下,6種四環(huán)素在1～100 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,線性相關(guān)系數(shù)為0.996 7～0.999 3,檢出限為2.44～25.21 ng/L,樣品加標(biāo)回收率為80.6%～90.0%,日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSDs)為0.6%～2.5%,日間RSDs為1.1%～7.1%。該方法靈敏度高、背景干擾低,適用于環(huán)境水樣中6種痕量四環(huán)素類抗生素的同時(shí)檢測。

關(guān)鍵詞:磁性固相萃取;高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;四環(huán)素類抗生素;環(huán)境水樣

抗生素作為一種能抑制和殺滅細(xì)菌的藥物,已被廣泛用于醫(yī)療衛(wèi)生、畜禽養(yǎng)殖、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等行業(yè),為經(jīng)濟(jì)發(fā)展做出了很大的貢獻(xiàn)。在畜禽養(yǎng)殖業(yè),抗生素作為飼料添加劑用于預(yù)防和治療動物疾病,促進(jìn)動物生長。但過量使用抗生素對環(huán)境微生物種群造成惡劣影響,使耐藥菌在環(huán)境中被誘發(fā)和散播,進(jìn)而對水體系統(tǒng)產(chǎn)生不可逆轉(zhuǎn)的破壞,對人類健康和生態(tài)環(huán)境也帶來了潛在的風(fēng)險(xiǎn)。四環(huán)素類抗生素(TCs)是由鏈霉菌產(chǎn)生的一類廣譜抗生素,主要包括四環(huán)素、土霉素、金霉素等。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[1-3]報(bào)道,四環(huán)素類抗生素已經(jīng)進(jìn)入環(huán)境水中,引起了人們的高度重視。

圖 1　　　6種四環(huán)素類抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig. 1　　　Chemical structures of the six tetracycline antibiotics

四環(huán)素類抗生素的檢測方法有熒光分析法[4]、毛細(xì)管電泳法[5]、免疫分析法[6]、薄層色譜法[7]、液相色譜法[8,9]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[10-18]等。其中,高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法具有分離良好、檢測靈敏等特點(diǎn),越來越多地用于四環(huán)素類抗生素的檢測中。目前,用于四環(huán)素類抗生素復(fù)雜基質(zhì)樣品的前處理方法主要有固相萃取、傳統(tǒng)熱水萃取法、QuEChERS等。水體中的抗生素濃度通常較低,僅為ng/L至μg/L數(shù)量級,因此研究開發(fā)快速、準(zhǔn)確檢測環(huán)境水中痕量四環(huán)素類抗生素的高靈敏度分析方法具有重要意義?？紤]到環(huán)境水樣的復(fù)雜性和四環(huán)素類抗生素在水體中濃度較低的特點(diǎn),檢測前必須進(jìn)行濃縮、富集及凈化等預(yù)處理。磁性固相萃取(MSPE)[19,20]是一種以磁性或可磁化的材料作吸附劑基質(zhì)的一種固相萃取技術(shù),它保留了傳統(tǒng)固相萃取簡單、高效和有機(jī)溶劑耗量少的優(yōu)點(diǎn)。在磁性固相萃取過程中,磁性吸附劑不是填充到吸附柱中,而是直接被添加到樣品的溶液或懸浮液中,將目標(biāo)化合物吸附到分散的磁性吸附劑表面,在外部磁場作用下就可使目標(biāo)化合物與樣品基質(zhì)分離。近年來,有研究者[21-25]用磁性固相萃取技術(shù)進(jìn)行樣品預(yù)處理并取得了很好的應(yīng)用效果,避免了普通固相萃取技術(shù)中過柱操作繁瑣、吸附柱容易堵塞、重復(fù)性差等問題,同時(shí)具備富集效率高、分離過程簡便等優(yōu)點(diǎn),因而具有很好的應(yīng)用前景。

本文采用磁性材料作為固相萃取劑進(jìn)行樣品前處理,建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定環(huán)境水樣中四環(huán)素類抗生素的分析方法。相較于其他以有機(jī)試劑作為洗脫溶劑的前處理方法,本實(shí)驗(yàn)采用水作為洗脫劑,綠色環(huán)保,分離快速、簡便,回收率高,靈敏度高,重復(fù)性好,可用于環(huán)境水樣的檢測。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(Agilent 1290 Infinity/6460 Triple Quad,美國Agilent公司); Milli-Q超純水器(美國Millipore公司); KQ-100DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

甲醇、乙腈均為色譜純(美國Sigma-Aldrich公司);二氯甲烷為分析純(杭州雙林化工試劑廠);乙酸為分析純(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司);質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的氨水(杭州龍山精細(xì)化工有限公司);實(shí)驗(yàn)用水為超純水;磁性材料由浙江大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院環(huán)境科學(xué)研究所文岳中課題組提供。

標(biāo)準(zhǔn)品:差向四環(huán)素(4-epitetracycline,ETC,純度≥95%)、土霉素(oxytetracycline,OTC,純度≥95%)、四環(huán)素(tetracycline,TC,純度≥95%)、去甲金霉素(demclocycline,DMC,純度≥95%)、金霉素(chlortetracycline,CTC,純度≥95%)和脫水四環(huán)素(anhydrotetracycline,ATC,純度≥95%)均購自百靈威公司。6種四環(huán)素類抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。

分別準(zhǔn)確稱取一定量的6種四環(huán)素類抗生素標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇溶解并配制成1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,分別吸取一定量標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制成1 000 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液及不同濃度的單標(biāo)準(zhǔn)工作液,儲存于-4 ℃冰箱中。

磁性萃取材料GO/nZVI由浙江大學(xué)提供,是納米零價(jià)鐵(nZVI)和氧化石墨烯(GO)的復(fù)合物,具有pH調(diào)控特性。

1.2樣品前處理方法

水樣采自杭州地區(qū)不同河段,所有水樣均通過0.45 μm濾膜過濾除去懸浮物。量取100 mL水樣于200 mL燒杯中,加入15 mg磁性材料,在40 ℃恒溫水浴中加熱攪拌15 min進(jìn)行磁性固相萃取,使用磁鐵收集萃取完全后的磁性材料,棄去萃取后的水樣。然后用pH 11的氨水水溶液作洗脫劑,在室溫下超聲10 min進(jìn)行洗脫,并在磁鐵作用下收集洗脫溶液,用pH 11的氨水水溶液定容至10 mL,經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后,用HPLC-MS/MS進(jìn)行定量分析。

1.3HPLC-MS/MS條件

1.3.1HPLC條件

色譜柱:ZORBAX Eclipse Plus C18(100 mm×3.0 mm, 1.8 μm);柱溫:35 ℃;進(jìn)樣體積:10 μL;流速:0.3 mL/min;流動相為乙腈(A)和1%(體積分?jǐn)?shù))乙酸水溶液(B)。梯度洗脫程序:0～10 min, 10%A～30%A; 10～11 min, 30%A～100%A; 11～14 min, 100%A～10%A; 14～17 min, 10%A。

1.3.2MS/MS條件

采用電噴霧離子(ESI)源,正離子模式,使用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式進(jìn)行檢測。干燥氣溫度:300 ℃;干燥氣流速:5 L/min;霧化氣壓力:0.31 MPa;鞘氣溫度:250 ℃;鞘氣流速:10 L/min;毛細(xì)管電壓:3 500 V;噴嘴電壓:1 000 V;干燥氣、霧化氣和鞘氣均為高純氮?dú)狻?/p>

2結(jié)果與討論

2.1色譜條件和質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將6種四環(huán)素類抗生素的單標(biāo)準(zhǔn)工作液直接進(jìn)樣,先進(jìn)行全掃描,準(zhǔn)確找出準(zhǔn)分子離子[M+H]+,然后對準(zhǔn)分子離子進(jìn)行轟擊獲得二次碎裂的子離子,將準(zhǔn)分子離子和2個(gè)信號強(qiáng)度最高的子離子組成監(jiān)測離子對,以MRM模式檢測。在此基礎(chǔ)上重點(diǎn)優(yōu)化對靈敏度影響較大的毛細(xì)管電壓和噴嘴電壓,使選定的母離子和子離子組成的特征離子豐度達(dá)到最佳,選擇其中豐度較大的子離子作為定量離子。6種四環(huán)素類抗生素的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表 1　　　多反應(yīng)監(jiān)測模式下6種四環(huán)素類抗生素的質(zhì)譜參數(shù)

*Quantitative ion pair.

在優(yōu)化的梯度洗脫程序下,除差向四環(huán)素和土霉素?zé)o法很好分離外,其余4種四環(huán)素類抗生素均能實(shí)現(xiàn)基線分離。6種四環(huán)素類抗生素(50 μg/L)的MRM譜圖見圖2。

圖 2　　　6種四環(huán)素類抗生素(50 μg/L)的MRM譜圖Fig. 2　　　MRM chromatogram of the six tetracycline 　　　antibiotics (50 μg/L)

2.2磁性固相萃取條件的優(yōu)化

在磁性固相萃取過程中,影響萃取效率的主要因素有萃取時(shí)間、萃取溫度、磁性材料的用量、洗脫溶劑的種類及pH值、洗脫時(shí)間、離子強(qiáng)度等,分別對這些因素進(jìn)行了優(yōu)化。

圖 3　　　萃取時(shí)間對6種四環(huán)素類抗生素吸附率的影響Fig. 3　　　Effect of the extraction time on the adsorption 　　　rates of the six tetracycline antibiotics (TCs)　Extraction conditions: GO/nZVI, 10 mg; sample volume, 100 mL; mass concentration of TCs, 10 μg/L; extraction temperature, 40 ℃.

2.2.1萃取時(shí)間

萃取時(shí)間是固相萃取技術(shù)的重要參數(shù)之一。當(dāng)吸附劑與目標(biāo)化合物之間未達(dá)到吸附平衡時(shí),萃取效率會隨著萃取時(shí)間的增加而增加。同時(shí),在保證富集效果的前提下,應(yīng)該盡量縮短萃取時(shí)間。試驗(yàn)考察了萃取時(shí)間分別為1、5、8、10、15、30和60 min時(shí)對萃取效果的影響。如圖3所示,萃取時(shí)間為15 min時(shí),6種四環(huán)素類抗生素的萃取效率基本不再升高,萃取效率趨于穩(wěn)定。

2.2.2萃取溫度

考察了萃取溫度分別為10、20、30、40、50和60 ℃時(shí)的萃取效果(見圖4)。結(jié)果表明,萃取溫度在40 ℃以下時(shí),磁性材料對6種四環(huán)素類抗生素的吸附率隨萃取溫度的升高而增大,這可能是由于溫度升高使分子熱運(yùn)動加快,目標(biāo)化合物和磁性固相材料分子表面的羧基和羥基的締和機(jī)會增加,從而使萃取效率增加。在40 ℃時(shí),6種四環(huán)素類抗生素的吸附率均已達(dá)到96%以上,溫度繼續(xù)升高吸附率變化不大,吸附萃取基本達(dá)到平衡,因此最終選擇萃取溫度為40 ℃。

圖 4　　　萃取溫度對6種四環(huán)素類抗生素吸附率的影響Fig. 4　　　Effect of the extraction temperature on the　　　adsorption rates of the six tetracycline antibiotics　Extraction conditions: GO/nZVI, 10 mg; sample volume, 100 mL; mass concentration of TCs, 10 μg/L; extraction time, 15 min.

2.2.3磁性材料的用量

在100 mL水樣中分別加入5、10、15、20和25 mg磁性材料,考察了磁性材料的用量對6種四環(huán)素類抗生素富集效果的影響(見圖5)。結(jié)果表明,當(dāng)磁性材料用量從5 mg增至15 mg時(shí),6種四環(huán)素類抗生素的吸附率均明顯增加,但繼續(xù)增加磁性材料用量,吸附率無明顯增加。故選擇在100 mL水中加入15 mg磁性材料進(jìn)行吸附萃取。

圖 5　　　磁性材料用量對6種四環(huán)素類抗生素吸附率的影響Fig. 5　　　Effect of the magnetic material dosages on　　　the adsorption rates of the six tetracycline antibiotics　Extraction conditions: sample volume, 100 mL; mass concentration of TCs, 10 μg/L; extraction temperature, 40 ℃; extraction time, 15 min.

圖 6　　　不同洗脫溶劑對6種四環(huán)素類抗生素回收率的影響Fig. 6　　　Effect of different desorption solvents on the 　　　recoveries of the six tetracycline antibiotics　Extraction conditions: GO/nZVI, 15 mg; sample volume, 100 mL; mass concentration of TCs, 10 μg/L; extraction temperature, 40 ℃; extraction time, 15 min; desorption time, 5 min; pH value of the desorption solvent, 11.

2.2.4洗脫溶劑的種類

洗脫溶劑的種類是影響洗脫效率的重要因素,使用合適的洗脫溶劑能夠使待測物更容易地被洗脫下來。試驗(yàn)選取二氯甲烷、甲醇、水和乙腈等常用的溶劑作為洗脫溶劑,考察了其對6種四環(huán)素類抗生素洗脫效率的影響(見圖6)。結(jié)果表明,采用水作為洗脫溶劑對6種四環(huán)素類抗生素的洗脫效率最大,且基底雜質(zhì)較少,因此選擇水作為洗脫溶劑。

2.2.5洗脫溶劑的pH值

四環(huán)素類抗生素的質(zhì)子化形式易于被磁性材料吸附,去質(zhì)子化形式易于洗脫。當(dāng)pH值為9～11時(shí),四環(huán)素類抗生素以負(fù)離子形式存在,由于磁性材料與羥基結(jié)合獲得負(fù)電荷,所以在靜電斥力的作用下易于洗脫。當(dāng)pH值達(dá)到11時(shí),洗脫劑對四環(huán)素類抗生素的洗脫效果最優(yōu),6種四環(huán)素類抗生素的回收率均大于80%(見圖7)。當(dāng)pH值大于11時(shí),四環(huán)素類抗生素在強(qiáng)堿性條件下不穩(wěn)定,影響洗脫效率。所以選擇pH 11的氨水溶液作為洗脫劑。

圖 7　　　洗脫溶劑pH值對6種四環(huán)素類抗生素回收率的影響Fig. 7　　　Effect of different pH values of the desorption　　　solvent on the recoveries of the six tetracycline antibiotics　Extraction conditions: GO/nZVI, 15 mg; sample volume, 100 mL; mass concentration of TCs, 10 μg/L; extraction temperature, 40 ℃; extraction time, 15 min; desorption time: 5 min, desorption solvent: water.

CompoundLinearequationr2Linearrange/(μg/L)LOD/(ng/L)LOQ/(ng/L)ETCy=26781.9x+25238.90.99751-1009.2030.67OTCy=26322.5x+53807.50.99841-1003.4911.64TCy=31525.8x+12857.20.99931-1004.7815.92DMCy=11614.6x-372.30.99911-10025.2184.03CTCy=8760.0x+2799.70.99931-10020.9869.93ATCy=25278.8x+30483.60.99671-1002.448.14

y: peak area;x: mass concentration, μg/L.

2.2.6洗脫時(shí)間

為縮短樣品前處理時(shí)間,對樣品的洗脫時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化,在2、5、8、10、15和20 min時(shí)考察了6種四環(huán)素類抗生素的回收率。如圖8所示,洗脫時(shí)間為10 min時(shí),回收率基本達(dá)到最大值,超過10 min后回收率趨于平穩(wěn),因此選擇洗脫時(shí)間為10 min。

圖 8　　　洗脫時(shí)間對6種四環(huán)素類抗生素回收率的影響Fig. 8　　　Effect of the desorption time on the recoveries 　　　of the six tetracycline antibiotics　Extraction conditions: GO/nZVI, 15 mg; sample volume, 100 mL; mass concentration of TCs, 10 μg/L; extraction temperature, 40 ℃; extraction time, 15 min; desorption solvent, water; pH value of the desorption solvent, 11.

此外,還考察了樣品溶液的離子強(qiáng)度對磁性固相萃取效率的影響,通過加入不同質(zhì)量濃度的NaCl來增加離子強(qiáng)度,結(jié)果表明NaCl濃度對萃取效率影響很小,并且NaCl會污染質(zhì)譜離子源,因此實(shí)驗(yàn)中不加入NaCl。

2.3方法學(xué)評價(jià)

2.3.1線性范圍、檢出限與定量限

準(zhǔn)確量取適量的6種四環(huán)素類抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(1 000 μg/L),用甲醇稀釋,獲得質(zhì)量濃度分別為1、5、10、20、50和100 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,按1.2節(jié)方法處理后建立定量離子峰面積(y)與質(zhì)量濃度(x, μg/L)的線性關(guān)系。結(jié)果表明,6種四環(huán)素類抗生素在1～100 μg/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)r2≥0.996,檢出限(LODs,S/N=3)和定量限(LOQs,S/N=10)范圍分別是2.44～25.21 ng/L和8.14～84.03 ng/L(見表2)。

此外,表3列出了本方法與其他方法對目標(biāo)化合物檢出限的對比結(jié)果,與文獻(xiàn)[5,18,22-26]相比,本方法對目標(biāo)化合物的檢出限更低。本方法簡單快速,由于采用磁性固相萃取作為樣品前處理手段,避免了過濾、離心等繁瑣步驟,可進(jìn)行批量操作。本方法的靈敏度可以滿足對環(huán)境水中痕量四環(huán)素類抗生素的分析。

表 3　　　本方法與其他方法對6種四環(huán)素類抗生素檢出限的比較

FASI: field-amplified sample injection; HDI: hydrodynamic injection; MAE: microwave-assisted extraction. -: not mentioned.

2.3.2回收率和精密度

在已知質(zhì)量濃度為10 μg/L的水樣中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液,進(jìn)行加標(biāo)回收率的測定。加入不同體積的6種四環(huán)素類抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)工作液(1 000 μg/L),配制成30、50和70 μg/L 3個(gè)質(zhì)量濃度水平的水樣進(jìn)行實(shí)際樣品加標(biāo)試驗(yàn),每個(gè)水平測定5次。按1.2節(jié)方法處理后進(jìn)行HPLC-MS/MS測定,計(jì)算回收率。分別在樣品處理當(dāng)日不同時(shí)間點(diǎn)和處理后不同天數(shù)進(jìn)樣分析(n=5),計(jì)算日內(nèi)和日間精密度。6種四環(huán)素類抗生素的加標(biāo)回收率均大于80%,日內(nèi)精密度和日間精密度分別不高于2.5%和7.1%?；厥章屎途芏冉Y(jié)果見表4。

表 4　　　6種四環(huán)素類抗生素在環(huán)境水樣中的回收率和精密度

2.4實(shí)際樣品分析

利用本文建立的方法分析了杭州市郊區(qū)河段中四環(huán)素類抗生素的殘留,5份水樣分別取自該河段中不同排污口附近。結(jié)果表明,5份水樣均有不同種類和含量的四環(huán)素類抗生素檢出(見表5)。圖9是實(shí)際水樣經(jīng)磁性固相萃取前后的MRM譜圖。本方法具有良好的實(shí)用性,可應(yīng)用于不同環(huán)境水樣中四環(huán)素類抗生素的測定。

表 5　　　實(shí)際水樣中6種四環(huán)素類抗生素的含量(n=3)

ND: not detected.

圖 9　　　實(shí)際水樣中6種四環(huán)素類抗生素的MRM譜圖Fig. 9　　　MRM chromatograms of the six tetracycline 　　　antibiotics in water sample　1. ETC; 2. OTC; 3. TC; 4. ATC.

3結(jié)論

本文建立了基于GO/nZVI的磁性固相萃取-HPLC-MS/MS分析測定環(huán)境水樣中的6種四環(huán)素類抗生素的方法,分別對色譜及質(zhì)譜條件、萃取時(shí)間、萃取溫度、磁性材料用量、洗脫劑種類和洗脫劑的pH值進(jìn)行了優(yōu)化。本方法操作簡便、快速、綠色環(huán)保、結(jié)果可靠、檢出限低、重現(xiàn)性好,可應(yīng)用于不同環(huán)境水樣中四環(huán)素類抗生素的測定。

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Determination of tetracycline antibiotics in environmental water using magnetic solid phase extraction combined with high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

GUO Ming, YU Feng*, JIA Keling, LI Jiao, SUN Hai

(Zhejiang Research Institute of Chemical Industry, Hangzhou 310023, China)

Abstract:A method has been developed for the simultaneous determination of tetracycline antibiotics in environmental water by magnetic solid phase extraction and high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Several important parameters affecting the magnetic solid phase extraction procedure have been optimized for the best recovery. The eluate was analyzed by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) under multiple reaction monitoring (MRM) mode with a ZORBAX Eclipse Plus C(18) column. Under the optimized conditions, the six tetracycline antibiotics (4-epitetracycline, oxytetracycline, tetracycline, demclocycline, chlortetracycline,anhydrotetracycline) showed good linearities in the range of 1-100 μg/L with the correlation coefficients of 0.996 7-0.999 3. The limits of detection (LODs) were in the range of 2.44 ng/L to 25.21 ng/L. The spiked recoveries were 80.6%-90.0%. The intra-day relative standard deviations (RSDs) were 0.6%-2.5%, while the inter-day RSDs were 1.1%-7.1%. The method has low background and high sensitivity. It was successfully applied to the simultaneous determination of the six trace tetracycline antibiotics in environmental water.

Key words:magnetic solid phase extraction; high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS); tetracycline antibiotics; environmental water

中圖分類號:O658

文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

文章編號:1000-8713(2016)04-0407-07

基金項(xiàng)目:浙江省公益性技術(shù)應(yīng)用研究(分析測試)項(xiàng)目(2014C37090).

*收稿日期:2015-11-23

DOI:10.3724/SP.J.1123.2015.11038

*通訊聯(lián)系人. Tel:(0571)81182373,E-mail:y_u_f2006@163.com.

Foundation item: Zhejiang Provincial Public Service Technology Applied Research (Analysis Test) Project (No. 2014C37090).