陳爾凝,　趙新穎,　屈　鋒

(1. 北京理工大學(xué)生命學(xué)院, 北京 100081; 2. 北京市理化分析測試中心, 北京 100089)

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細(xì)菌的核酸適配體篩選的研究進展

陳爾凝1,2,趙新穎2,屈鋒1*

(1. 北京理工大學(xué)生命學(xué)院, 北京 100081; 2. 北京市理化分析測試中心, 北京 100089)

摘要:核酸適配體(aptamer)是通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化技術(shù)(SELEX)篩選的能夠以高親和力和高特異性識別靶標(biāo)分子或細(xì)胞的核糖核酸(RNA)和單鏈脫氧核糖核酸(ssDNA)。作為化學(xué)抗體,核酸適配體的制備和合成比抗體的成本更低。核酸適配體的靶標(biāo)范圍極其廣泛,包括小分子、生物大分子、細(xì)菌和細(xì)胞等。針對細(xì)菌靶標(biāo)篩選的適配體,目前主要應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和環(huán)境中的細(xì)菌檢測。細(xì)菌的核酸適配體篩選可以通過離心法將菌體-適配體復(fù)合物與游離的適配體分離,并通過熒光成像、熒光光譜分析、流式細(xì)胞儀分選、DNA捕獲元件、酶聯(lián)適配體分析等方法表征適配體與靶標(biāo)的相互作用。篩選出的適配體可結(jié)合生物、化學(xué)檢測方法用于細(xì)菌檢測。本文介紹了細(xì)菌適配體的篩選和表征方法以及基于適配體的檢測方法的最新進展,分析了不同檢測方法的利弊,并列出了2011～2015年篩選的細(xì)菌的核酸適配體。

關(guān)鍵詞:核酸適配體;細(xì)菌;篩選;指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化技術(shù);綜述

核酸適配體(aptamer)是指通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術(shù)(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)體外篩選的能與靶標(biāo)高親和性和高特異性結(jié)合的核糖核酸(RNA)和單鏈脫氧核糖核酸(ssDNA)[1]。它通常由幾十個核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸單體組成,通過堿基的分子內(nèi)氫鍵作用,形成復(fù)雜的二級或三級結(jié)構(gòu),如發(fā)卡、莖環(huán)、G-四連體等。篩選適配體的主要步驟包括建立隨機寡核苷酸庫(簡稱“核酸庫”)、表征核酸庫與靶標(biāo)的相互作用、分離靶標(biāo)核酸復(fù)合物,通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)擴增可與靶標(biāo)結(jié)合的核酸形成新的次級庫。多次重復(fù)以上篩選步驟(一般需要4～20輪)以獲得親和力高、特異性好的適配體。篩選的最后步驟還包括核酸序列測序并計算它與靶標(biāo)形成的復(fù)合物的平衡解離常數(shù)(Kd)等。人工構(gòu)建的核酸庫一般包括正向引物序列、20～60個隨機核苷酸序列、反向引物序列3部分。如篩選RNA適配體則需使用RNA庫,首先要將RNA分子逆轉(zhuǎn)錄為互補DNA(cDNA)后再進行擴增。由于RNA容易降解,故在篩選過程及應(yīng)用時需要采取保護措施,如使用2-氟-2-脫氧胞苷三磷酸和2-氟-2-脫氧尿苷三磷酸合成RNA[2]。篩選ssDNA適配體則相對簡單,因ssDNA庫可直接合成無需逆轉(zhuǎn)錄步驟,且DNA的穩(wěn)定性優(yōu)于RNA,合成和純化步驟較簡單。

適配體作用的靶標(biāo)范圍很廣,包括小分子、生物大分子(蛋白質(zhì)和酶)、細(xì)菌及細(xì)胞等。因細(xì)菌廣泛存在于空氣、水、土壤以及各種生活環(huán)境中,故在食品、環(huán)境、醫(yī)藥等領(lǐng)域的細(xì)菌分析檢測必不可少。傳統(tǒng)的細(xì)菌檢測需要通過細(xì)菌培養(yǎng)、生化鑒定、抗體識別、PCR等分析手段完成。這些檢測方法耗時長、成本高、不夠便利。而使用適配體則無需對細(xì)菌進行大量培養(yǎng),也無需裂解提取DNA,有望實現(xiàn)原位在線檢測。相比抗體,適配體的化學(xué)結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定、相對分子質(zhì)量更小,完全通過人工合成方法大量制備,無需實驗動物,故制備周期短并且成本低。理論上,任何細(xì)菌都有可能通過SELEX方法篩選得到其適配體。

多篇綜述總結(jié)了細(xì)菌的適配體應(yīng)用研究。Maureen等[3]統(tǒng)計了1990～2013年的492篇適配體篩選文獻,其中有6%的文獻是以細(xì)菌或真核細(xì)胞為靶標(biāo)。Torres-Chavolla等[4]總結(jié)了2009年前的全細(xì)胞靶標(biāo)的適配體篩選,其中應(yīng)用于細(xì)菌檢測的有5篇。Hamula等[5]總結(jié)了2011年前致病菌適配體的篩選與應(yīng)用,其中有12篇文獻報道了以全細(xì)胞方式篩選的適配體,涵蓋了8屬9種病原菌。另有20篇文獻以菌體分子為靶標(biāo),涉及11種細(xì)菌。針對適配體的應(yīng)用,Amaya-González等[6]介紹了2004～2013年適配體在食品細(xì)菌檢測領(lǐng)域的應(yīng)用,這些應(yīng)用基于適配體分析、適配體傳感器和適配體芯片3個層次。Gedi等[7]總結(jié)了2014年前有關(guān)適配體與納米顆粒結(jié)合的應(yīng)用技術(shù),介紹了針對8屬10種病原菌的13篇文獻。McKeague等[8]總結(jié)了2011年前發(fā)表的適配體傳感器在食品細(xì)菌檢測領(lǐng)域的應(yīng)用研究,包括了8屬11種細(xì)菌的13個適配體傳感器,其中RNA適配體4個,ssDNA適配體9個。Ozalp等[9]總結(jié)了2013年前具有抗菌活性的適配體,這些適配體可以抑制細(xì)菌代謝、促進人體免疫反應(yīng)或者阻礙細(xì)菌侵染人體。2011～2015年報道的細(xì)菌的適配體篩選,ssDNA適配體有15篇,RNA適配體為2篇(見表1)[10-26]。相比大量的應(yīng)用需求,實際可用的細(xì)菌適配體還極其有限,細(xì)菌適配體的篩選以及使用還面臨很大的困難。目前,細(xì)菌的適配體還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足實際應(yīng)用需要,其中適配體的有效篩選是關(guān)鍵,也是瓶頸問題。本文總結(jié)了2011～2015年基于細(xì)菌全細(xì)胞的適配體篩選方法、適配體的親和力和特異性表征方法以及適配體在細(xì)菌分析檢測中的最新進展。

表 1　　　細(xì)菌全細(xì)胞的核酸適配體序列及其平衡解離常數(shù)(Kd)

表 1　　　(續(xù))

* Primers are marked with brackets. Show only favored (with lowestKdor suggested by author) sequences. FC, flow cytometry; FI, fluorescent imaging; FS, fluorescence spectrometry; DCE, DNA capture element; SPR, surface plasmon resonance; ELASA, enzyme linked aptamer sorbent assay. NA, not mentioned.

1靶標(biāo)類型

針對細(xì)菌靶標(biāo)的適配體篩選,一般是以菌體表面分子為靶標(biāo)或以全細(xì)胞為靶標(biāo)。基于菌體表面分子的篩選,通常需將靶標(biāo)細(xì)菌滅活,再分離純化菌體表面的蛋白質(zhì)、多糖等分子,并以這些大分子作為靶標(biāo)[23,27]。此種針對表面分子的篩選方法與蛋白質(zhì)、小分子等靶標(biāo)的適配體篩選方法類似[5]。由于對菌體表面分子的分離純化改變了其處于菌體表面時的空間構(gòu)型和環(huán)境狀態(tài),與其在細(xì)菌表面時的天然結(jié)構(gòu)存在差異[16],因而基于表面分子篩選的適配體在全細(xì)胞檢測中應(yīng)用時,顯然與針對表面分子檢測時不一致,這種針對表面分子篩選的適配體通常并不完全適用于全細(xì)胞檢測。所以直接使用完整的菌體細(xì)胞(滅活或活體)作為靶標(biāo),將最大限度地保持菌體的天然狀態(tài)和表面分子的天然結(jié)構(gòu),有利于對實際菌體樣品的檢測。而且直接利用全細(xì)胞菌體為靶標(biāo),還無需分離和提純菌體表面分子,大大簡化篩選步驟和復(fù)雜過程。特別值得一提的是,以單一來源的細(xì)菌為靶標(biāo)篩選得到的適配體,往往可以與同種細(xì)菌的不同來源的菌株結(jié)合。如由大腸桿菌(E.coli)(KCTC 2571)篩選得到的4條適配體E1、E2、E10和E12均可與E.coliKCTC 1681、KCTC 2617和KCTC 2618有較強的結(jié)合,但與不同種屬的K.pneumonia、C.freundii、E.aerogenes或S.epidermidis的結(jié)合很弱[11],表明該適配體同時具有種內(nèi)識別的通用性和種間識別的特異性,可以用于種水平上的細(xì)菌檢測與鑒定,但是不能用于菌株鑒定。

然而,由于細(xì)菌存在細(xì)胞壁以及部分細(xì)菌莢膜結(jié)構(gòu),適配體很難直接與菌體表面特異性的蛋白質(zhì)或多糖接觸。而且不同溫度和不同培養(yǎng)基等條件下培養(yǎng)的細(xì)菌,其菌體狀態(tài)也會存在差異。因此全細(xì)胞的適配體篩選的確存在更多困難。目前的全細(xì)胞適配體篩選,所用的菌體靶標(biāo)既有滅活的菌體(如乙醇或甲醛滅活),也有活的細(xì)菌[22,24,28],對菌體細(xì)胞表面的不同處理方式肯定影響篩選的適配體的親和力。本課題組的研究表明，使用E.coli與嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)的原生質(zhì)體作為靶標(biāo)可以篩選到親和力更強的適配體,用乙醇滅活的大腸桿菌比甲醛滅活的大腸桿菌對核酸庫的親和力更強[29]。此外,滅活的菌體可以一次大量制備獲得,便于滿足后續(xù)多輪篩選的需要,也有利于菌體的定量、減小實驗誤差。但是滅活過程也會導(dǎo)致菌體表面蛋白質(zhì)變性,與實際活菌檢測的表面狀態(tài)不同。而以活菌為靶標(biāo)時,雖不存在表面蛋白質(zhì)的變性問題,但不同批次以及不同測定時間的活菌的數(shù)量和生長狀態(tài)存在一定差異,故需先對活菌定量(菌落計數(shù)或測定吸光度),并檢測和表征其生長狀態(tài),減少活菌靶標(biāo)的性狀差異,提高活菌檢測的重現(xiàn)性。

2篩選方法

全細(xì)胞菌體的適配體篩選前,需先將人工合成的隨機核酸庫進行熱變性(95 ℃, 10 min)以破壞核酸分子間形成的聚合物,然后在冰上迅速降溫,避免核酸發(fā)生聚合,再與靶標(biāo)細(xì)胞在4～37 ℃下靜置或輕柔振蕩孵育30～90 min,以形成核酸-菌體復(fù)合物。Shamah等[30]認(rèn)為4 ℃孵育可以減少DNA降解,有利于適配體的篩選。另一方面,如考慮到適配體應(yīng)用于細(xì)菌檢測時的環(huán)境溫度,室溫或37 ℃孵育與實際應(yīng)用條件更接近。

孵育完成后,可通過離心去除上清液中游離的核酸,并多次洗滌菌體沉淀,再將核酸-菌體復(fù)合物加熱變性,使菌體細(xì)胞與核酸分離。離心回收上清液。對上清液中的核酸進行PCR擴增,再通過核酸的單鏈制備,得到次級單鏈核酸庫。核酸庫與初始核酸庫相比,對靶標(biāo)結(jié)合的親和力有所提高。重復(fù)以上孵育-分離-擴增的篩選過程,經(jīng)過多輪篩選直到獲得對靶標(biāo)具有高親和力(nmol/L數(shù)量級)的核酸。對核酸進行測序,并測定其與靶標(biāo)結(jié)合的Kd值。進一步檢測其特異性,選出兼具高特異性與高親和力的核酸序列作為該種細(xì)菌的適配體。全細(xì)胞菌體的適配體篩選過程中,離心法是高效分離游離核酸與靶標(biāo)-核酸復(fù)合物的主要方法。

目前全細(xì)胞的適配體篩選主要使用離心法分離菌體與游離的核酸。本課題組也使用了毛細(xì)管電泳(CE)進行適配體篩選。因ssDNA與靶標(biāo)細(xì)菌形成復(fù)合物后,其質(zhì)荷比變化導(dǎo)致在CE中的遷移率改變。CE過程中,ssDNA、靶標(biāo)、靶標(biāo)-核酸復(fù)合物具有不同的遷移速率,故可通過CE分離并收集靶標(biāo)-核酸復(fù)合物,同時還可對核酸庫與靶標(biāo)的親和作用進行比較[29]。因此,毛細(xì)管電泳是高效篩選適配體的有效方法之一,可在一次CE過程中完成復(fù)合物的收集和親和作用的比較。

為了提高篩選的適配體的特異性,篩選過程中通常需要使用反向篩選。即使用高濃度的非靶標(biāo)細(xì)胞與核酸庫共同孵育,以除去非特異性結(jié)合的核酸。反向篩選常在第2輪及之后的輪次進行,所選非靶標(biāo)細(xì)胞可以是其他種屬的細(xì)菌,對活細(xì)胞靶標(biāo)也可以使用滅活的靶細(xì)胞作為反向篩選的靶標(biāo)細(xì)胞[18]。Lee等[2]篩選E.coliO157的適配體時選用了同屬不同種的E.coliK12作為反向篩選的靶標(biāo)。Park等[21]使用銅綠假單胞菌與大腸桿菌作為反向篩選的靶標(biāo)用于Sal.typhimurium和Sal.enteritidis的適配體篩選。Labib等[18]篩選Sal.typhimurium的適配體時使用的是熱變性的靶細(xì)胞以及混合的S.enteritidis、E.coli、S.aureus、P.aeruginosa和C.freundii作為反向篩選的靶標(biāo),篩選到的適配體能區(qū)分死細(xì)胞與活細(xì)胞。需要注意的是,Duan等[22]在篩選S.dysenteriae的適配體時選擇了不同屬的S.aureus、Sal.typhimurium、E.coli、L.monocytogenes和V.parahaemolyticus4種菌作為反向篩選靶標(biāo),當(dāng)進行適配體的特異性驗證時,其對靶標(biāo)的親和力顯著高于同屬的S.boydii、S.sonnei和S.flexneri,這表明即使使用不同屬的菌株作為反向篩選的靶標(biāo),篩選的適配體也能對同屬不同種的細(xì)菌進行區(qū)分。同時也說明依據(jù)細(xì)菌的生化反應(yīng)、形態(tài)特征劃分的細(xì)菌種屬,不能很好地反應(yīng)細(xì)菌表面特征分子的差異。S.dysenteriae的表面特征分子與同屬的S.boydii、S.sonnei和S.flexneri間存在差異,應(yīng)該足以通過適配體進行鑒別,甚至不需要特別設(shè)置反向篩選的靶標(biāo)。另一方面,由于屬內(nèi)細(xì)菌的表面特征分子也存在較大差異,當(dāng)難以直接篩選屬內(nèi)通用的適配體時,可以優(yōu)化篩選方法,或者將一組針對屬內(nèi)不同種細(xì)菌的適配體聯(lián)合使用。

3適配體親和性與特異性表征

細(xì)菌靶標(biāo)與核酸結(jié)合的親和力和特異性是評價所篩選的適配體的重要參數(shù)。通常用靶標(biāo)-核酸復(fù)合物的Kd表征相互作用。Kd值越小表明兩者相互作用越強。當(dāng)使用梯度濃度的核酸與靶標(biāo)共同孵育后,檢測核酸-靶標(biāo)復(fù)合物的濃度,按公式(1)可求算Kd[24,25,31]。

(1)

式中:Y為核酸-靶標(biāo)復(fù)合物濃度;X為核酸濃度;Bmax為常數(shù)。Kd測定時可使用熒光標(biāo)記的核酸。通過測定復(fù)合物的熒光強度求算Y值。

3.1平衡解離常數(shù)的測定方法

3.1.1熒光成像法

將熒光標(biāo)記的核酸與靶標(biāo)的孵育混合物經(jīng)離心去除和清洗未結(jié)合的適配體后,置于熒光顯微鏡下觀測,直接對帶有熒光的成像菌體計數(shù),可求出Y值[11]。

3.1.2熒光光譜法

將核酸與靶標(biāo)的孵育混合物通過離心等方法分離后,使用熒光光譜儀測定核酸-靶標(biāo)復(fù)合物的熒光強度,可作為Y值[22]。

3.1.3流式細(xì)胞儀法

將孵育混合物通過流式細(xì)胞儀,測定帶有熒光標(biāo)記的核酸-靶標(biāo)復(fù)合物的數(shù)量[16]。流式細(xì)胞儀可以對復(fù)合物進行絕對定量,同時將核酸-靶標(biāo)復(fù)合物與游離的核酸或靶標(biāo)分離。

3.1.4表面等離子共振法

表面等離子共振(SPR)技術(shù)將50 μmol/L核酸固定在親和素芯片上,再通入109CFU/mL的靶標(biāo)細(xì)菌孵育10 min,然后用Biacore 3000測定[17]。結(jié)果經(jīng)軟件分析后可求得Kd值。由于SPR可以直接檢測適配體與靶標(biāo)的結(jié)合狀態(tài),因此無需額外對適配體進行修飾,最大限度地保持了適配體的空間結(jié)構(gòu)。

3.1.5DNA捕獲元件(DCE)法

使用3′端帶有量子點或熒光基團標(biāo)記的適配體及5′端帶有猝滅基團的適配體的互補序列形成雙鏈DNA。加入靶標(biāo)后,因靶標(biāo)與適配體序列結(jié)合將釋放出5′端攜帶的猝滅基團的互補序列,而使適配體上的量子點或熒光基團發(fā)光。檢測熒光強度可定量檢測適配體-靶標(biāo)復(fù)合物的量。由于未與靶標(biāo)結(jié)合的適配體的熒光被猝滅,因而此方法的背景熒光低,具有較高的靈敏度[10]。

3.1.6酶聯(lián)適配體分析法(ELASA)

將5′端標(biāo)記有巰基的RNA適配體固定在銀膜上,經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)洗脫未固定的適配體后,加入靶標(biāo)細(xì)菌。孵育15 min后靶標(biāo)被銀膜上的適配體捕獲固定,用PBS沖洗后,再加入帶有6-羥基熒光素(FAM)標(biāo)記的適配體繼續(xù)孵育,使其與靶標(biāo)形成適配體-細(xì)菌-適配體夾心型復(fù)合物,洗脫未結(jié)合的適配體后,通過熒光成像即可觀察到帶有熒光的復(fù)合物,從而對靶標(biāo)細(xì)菌進行定量分析[12]。

3.1.7毛細(xì)管電泳(CE)法

依據(jù)ssDNA、靶標(biāo)和ssDNA-靶標(biāo)復(fù)合物質(zhì)荷比的差異將3組分分離,并通過測定各組分的峰面積,根據(jù)公式(2)計算Kd值[29]。

(2)

式中:A0為靶標(biāo)加入前游離ssDNA的峰面積;A為靶標(biāo)加入后游離ssDNA的峰面積;[L]為靶標(biāo)的濃度。

在測定Kd值的同時,CE能夠?qū)sDNA-靶標(biāo)復(fù)合物分離富集,簡化了SELEX篩選的步驟。

3.2特異性驗證

篩選完成后,除了表征適配體的親和力,還需考察適配體對靶標(biāo)的特異性。特異性驗證可利用同種不同來源的菌株,也可用不同種屬的其他細(xì)菌。用單一菌種作為靶標(biāo)篩選的適配體,對同一種細(xì)菌不同來源的菌株系有結(jié)合作用,但無法識別不同種、不同屬的其他細(xì)菌,或?qū)ζ渌?xì)菌的親和力很弱[24,28]。例如Chang等[24]用金黃色葡萄球菌篩選得到的適配體對6株不同來源的金黃色葡萄球菌均有較強的結(jié)合,與11株不同屬的細(xì)菌沒有結(jié)合,而與2株同為葡萄球菌屬但不同種的細(xì)菌有較弱的結(jié)合。

4基于適配體的檢測方法

食品、醫(yī)藥、環(huán)境等領(lǐng)域中細(xì)菌的檢測非常普遍,具有重要的實用意義?；诳贵w的細(xì)菌檢測技術(shù),因其速度快、特異性高而倍受青睞。近年來篩選的適配體已經(jīng)可以部分替代抗體用于細(xì)菌的分析檢測。目前篩選的適配體的Kd值在10～103nmol/L,對不同細(xì)菌的檢出限因所用分析方法不同差別較大,其范圍在102～106CFU/mL之間。適配體的高特異性與高親和力的特點,使其可以很好地用于識別和捕獲靶標(biāo)細(xì)菌,基于此可設(shè)計多種細(xì)菌分析方法。目前用于細(xì)菌檢測的適配體方法有酶聯(lián)免疫、同位素標(biāo)記、熒光標(biāo)記、核酸染料、電化學(xué)傳感器、納米金顆粒、夾心法以及多適配體聯(lián)合等。

4.1用適配體固定細(xì)菌的酶聯(lián)免疫分析

為了從S.aureus和E.coliO157: H7的混合菌液中檢測Sal.typhimurium,將5′端標(biāo)記生物素的RNA適配體固定在包被有親和素的96孔板上,再將細(xì)菌樣品在96孔板上室溫孵育1 h,洗脫未結(jié)合的細(xì)菌后,加入該細(xì)菌特異性的抗體(一抗),再孵育、洗脫后,加入帶有辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗,再加入過氧化物酶底物溶液,在酶標(biāo)儀中檢測425 nm處的吸光值。利用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)原理,以適配體取代抗體固定抗原,可定量分析Sal.typhimurium,而不受其他細(xì)菌干擾[19]。

4.2放射性標(biāo)記適配體的液體閃爍計數(shù)法

使用帶有同位素標(biāo)記的適配體,則可以免除后續(xù)一抗、二抗的使用,直接進行檢測。如在小牛腸磷酸酶作用下將RNA適配體5′端脫磷酸后,用[γ-32P]ATP(腺苷三磷酸)在T4多聚核苷酸激酶作用下磷酸化,得到5′端有32P標(biāo)記的適配體。將待測的Sal.typhimurium包被在96孔板上,與帶有32P標(biāo)記的RNA適配體在室溫下共同孵育1 h,沖洗后用液體閃爍計數(shù)器測定與靶標(biāo)細(xì)胞結(jié)合的帶有同位素標(biāo)記的適配體,從而對靶標(biāo)進行定量,但是這種方法檢出限較高(106CFU/mL)[19]。

4.3熒光標(biāo)記適配體的熒光光譜法

除了同位素標(biāo)記,也可以在適配體上修飾熒光基團,用雙適配體夾心法進行細(xì)菌分析。如將生物素修飾的適配體包被在96孔板上,與靶標(biāo)志賀氏菌在室溫下共同孵育1 h,沖洗去除未結(jié)合的志賀氏菌后,加入帶有FAM熒光標(biāo)記的適配體在室溫下孵育1 h,沖洗2次后測定熒光強度,檢出限可達50 CFU/mL,并且在102～107CFU/mL范圍內(nèi)都有良好的線性關(guān)系(R2=0.995 4)[22]。

4.4量子點標(biāo)記適配體的熒光光譜法

與使用熒光基團標(biāo)記類似,在適配體上可以修飾量子點標(biāo)記。Duan等[32]將帶有量子點標(biāo)記的適配體與靶細(xì)胞V.parahaemolyticus或Sal.typhimurium在37 ℃下共同孵育1 h后,于3 000 r/min下離心除去未結(jié)合的適配體。使用流式細(xì)胞儀對適配體-細(xì)菌復(fù)合物進行分離計數(shù)。此外,用于針對兩種不同細(xì)菌的適配體上分別修飾了535 nm和585 nm兩種不同的量子點標(biāo)記,在流式細(xì)胞分選時可以同時檢測兩種細(xì)菌。相對于熒光基團標(biāo)記,量子點熒光的發(fā)射波長有更多的選擇,有利于多通道檢測,能夠?qū)崿F(xiàn)同時檢測多種細(xì)菌。

4.5上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒修飾適配體的熒光光譜法

上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒(upconversion nanoparticles, UCNP)利用反-斯托克斯發(fā)光(anti-Stokes)產(chǎn)生長壽命熒光,可以有效排除背景中細(xì)菌自發(fā)短壽命熒光的干擾,提高熒光信號的信噪比。Wu等[33]使用多色UCNP分別標(biāo)記了針對S.aureus、V.parahaemolyticus和S.typhimurium的適配體,結(jié)合磁分離技術(shù),在牛奶、對蝦樣品中同時檢測這3種致病菌,結(jié)果與傳統(tǒng)平板計數(shù)法一致。

4.6核酸染料輔助的適配體檢測方法

AccuBlue染料可以與雙鏈DNA(dsDNA)結(jié)合產(chǎn)生較強的熒光,但它單獨存在時或與ssDNA結(jié)合后產(chǎn)生的熒光較弱。將AccBlue染料、適配體、與適配體互補的ssDNA結(jié)合使用,可以用于細(xì)菌的定量檢測[34]。檢測方法分為兩種模式:(1)“signal on”模式。將靶標(biāo)細(xì)菌與一定量的適配體共同孵育,形成靶標(biāo)-適配體復(fù)合物,再加入適配體的互補序列與AccBlue染料,體系中游離的適配體與互補序列形成dsDNA,結(jié)合染料后產(chǎn)生熒光,測定熒光強度的增加即可知游離的適配體濃度,進而推算靶標(biāo)濃度。(2)“signal off”模式。將適配體與其互補序列先形成dsDNA與AccBlue染料產(chǎn)生熒光,再加入靶標(biāo)細(xì)菌與互補序列競爭結(jié)合適配體,導(dǎo)致熒光強度隨著dsDNA的減少而降低。對V.parahaemolyticus和S.typhimurium的檢出限分別達到35 CFU/mL和25 CFU/mL。由于是通過dsDNA間接測定適配體-靶標(biāo)復(fù)合物的濃度,因此針對不同樣品需要對核酸染料的用量進行優(yōu)化,才能得到較顯著的熒光強度的變化,以保證檢測的特異性和靈敏度。

4.7雙適配體夾心法

雙適配體夾心法(aptamer-based sandwich assay, ABSA)將適配體固定在96孔板上,加入樣品孵育30 min后,沖洗除去未結(jié)合的細(xì)菌,再加入帶有熒光修飾的適配體孵育,沖洗去除游離的適配體后測定熒光強度。Lee等[17]使用L.monocytogenes的適配體對不同濃度的靶標(biāo)細(xì)菌的菌懸液進行了測定,線性范圍為20～200 000 CFU/mL(R2=0.99)。

4.8多適配體聯(lián)合的熒光成像法

細(xì)菌表面的蛋白質(zhì)、多糖以及鞭毛等都有可能成為適配體作用的靶標(biāo)。故對同一細(xì)菌有可能篩選到針對蛋白質(zhì)、多糖以及鞭毛等多種靶標(biāo)的不同適配體。將這些適配體聯(lián)合使用,有助于對全細(xì)胞的高特異性結(jié)合,可以顯著提高檢測靈敏度與特異性。如Kim等[13]使用量子點標(biāo)記的3組不同適配體與E.coli結(jié)合,通過熒光成像發(fā)現(xiàn)這3組適配體可以同時非競爭性地與靶標(biāo)E.coli結(jié)合。聯(lián)合使用這3組適配體相對單獨使用一種適配體,對E.coli的檢出限從103CFU/mL降低到102CFU/mL。

4.9適配體修飾的阻抗傳感器法

適配體也可以與電化學(xué)檢測器聯(lián)用,從而提高靈敏度,進一步降低檢出限。Labib等[18]將篩選得到的鼠傷寒沙門氏菌的適配體用硫醇修飾后,通過自組裝結(jié)合到納米金修飾的碳電極上。通過測定適配體與靶標(biāo)結(jié)合前后阻抗的變化,即可對靶標(biāo)進行定量、定性分析。該方法可以從30 μL樣品中檢出最低18個細(xì)胞,且只檢測活的鼠傷寒沙門氏菌,對滅活的鼠傷寒沙門氏菌則沒有響應(yīng)。電化學(xué)的檢測方法有利于便攜檢測儀器的開發(fā)。

4.10納米金顆粒的比色法

先用納米金顆粒吸附鼠傷寒沙門氏菌或大腸埃希氏菌的適配體。當(dāng)這些適配體捕獲靶標(biāo)后,納米金顆粒會聚集沉淀,其溶液顏色由紅變紫,通過測定吸光度的變化,可對靶標(biāo)細(xì)菌進行定量。納米金顆粒對非靶標(biāo)的其他種屬的細(xì)菌如S.paratyphiA或金黃色葡萄球菌的吸附較少,故溶液顏色沒有變化。該方法的檢測特異性較好,但檢出限較高(105CFU/mL)[28]。

5結(jié)論與展望

細(xì)菌全細(xì)胞表面的分子組成和結(jié)構(gòu)復(fù)雜,具體信息未知。因此,利用全細(xì)胞篩選可以不受這些局限,針對其完整狀態(tài)篩選出可識別全細(xì)胞的適配體。提高細(xì)菌全細(xì)胞適配體篩選的成功率及其親和力和特異性,使適配體成為高效、穩(wěn)定的細(xì)菌識別分子,將是適配體廣泛用于細(xì)菌分析檢測的基礎(chǔ)。目前存在的問題是:(1)為保證適配體的高親和力,需要重復(fù)十幾甚至數(shù)十輪次的SELEX過程,篩選耗時長、步驟繁瑣、人力和財力成本很高。因缺少自動化的篩選方法和儀器,篩選輪次太多將使篩選的效率無法保證。(2)篩選過程中,難以監(jiān)測每輪次級庫的親和力變化。目前,除了CE方法便于連續(xù)監(jiān)測每輪篩選中次級庫的親和力變化外,其他篩選方法少有關(guān)于次級庫親和力變化的報道。(3)適配體的特異性高低在實際應(yīng)用中非常關(guān)鍵。特異性的提高受反向篩選的靶標(biāo)的影響。但目前反向篩選的靶標(biāo)選擇具有較大的隨意性,也缺少反向篩選靶標(biāo)對篩選特異性影響的研究?，F(xiàn)階段的主要解決方法是同時使用多種細(xì)胞作為反向篩選的靶標(biāo)以提高特異性。(4)適配體用于細(xì)菌檢測時的靈敏度還有很大的提升空間。使用熒光、同位素等手段標(biāo)記適配體,將其與其他傳感器、分析系統(tǒng)聯(lián)合使用,或利用針對同一靶標(biāo)的一組適配體代替單一適配體都可以降低檢出限。因此選擇合適的檢測方法將有助于改善適配體在細(xì)菌檢測中的應(yīng)用效果。通過檢測方法的優(yōu)化,也可以在一定程度上降低對適配體親和力和特異性的要求。目前,細(xì)菌全細(xì)胞的適配體篩選方法研究還不充分,適配體在細(xì)菌檢測中的應(yīng)用也還有很大的發(fā)展空間。

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Research advances of aptamers selection for bacterium targets

CHEN Erning1,2, ZHAO Xinying2, QU Feng1*

(1. School of Life Science, Beijing Institute of Technology, Beijing 100081, China;2. Beijing Center for Physical and Chemical Analysis, Beijing 100089, China)

Abstract:Aptamers are RNA or singal stranded DNA (ssDNA), which are selected by systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX). Compared to antibodies, aptamers as chemical antibodies are artificially synthesized with low cost. They can bind a wide range of targets, including small molecules, large biological molecules, bacteria and cells. Aptamers targeting bacteria have the potential to be used for pathogen detection in food, medicine and environment. To select aptamers with high affinity to bacteria, centrifugation is mostly used. Binding affinity can be estimated by fluorescence imaging, fluorescence spectra, flow cytometry, DNA capture element (DCE) and enzyme-linked aptamers sorbent assay (ELASA). Selected aptamers combined with biological and chemical analysis methods can be used in bacteria detection. This article introduces the latest development in aptamer selection, characterization and application for bacteria detection and summarizes the aptamers for bacteria from 2011 to 2015.

Key words:aptamer; bacteria; selection; systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX); review

中圖分類號:O658

文獻標(biāo)識碼:A

文章編號:1000-8713(2016)04-0389-08

基金項目:國家自然科學(xué)基金項目(21175011,21375008);北京市科學(xué)技術(shù)研究院青年骨干計劃項目.

*收稿日期:2015-12-17

DOI:10.3724/SP.J.1123.2015.12021

多尺度靶標(biāo)的核酸適配體篩選研究進展專欄

·專論與綜述

*通訊聯(lián)系人.Tel:(010)68918015,E-mail:qufengqu@bit.edu.cn.

Foundation item: National Nature Science Foundation of China (Nos. 21175011, 21375008); Key Youth Project of Beijing Academy of Science and Technology.