吳海燕,　郭萌萌,　趙春霞,　譚志軍*,

顧海峰3,　翟毓秀1,2,　盧立娜1,2

(1. 農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所, 山東 青島 266071;

2. 農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(青島), 山東 青島 266071;

3. 國家海洋局第三研究所, 福建 廈門 361000)

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研究論文

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法篩查原多甲藻酸毒素及其代謝產(chǎn)物

吳海燕1,2,郭萌萌1,2,趙春霞1,2,譚志軍1,2*,

顧海峰3,翟毓秀1,2,盧立娜1,2

(1. 農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所, 山東 青島 266071;

2. 農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(青島), 山東 青島 266071;

3. 國家海洋局第三研究所, 福建 廈門 361000)

摘要:建立了原多甲藻酸毒素(azaspiracids, AZAs)及其代謝產(chǎn)物的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法,考察了目標(biāo)代謝產(chǎn)物檢測(cè)方法和非目標(biāo)多離子檢測(cè)方法,將二級(jí)質(zhì)譜圖與標(biāo)準(zhǔn)品譜庫進(jìn)行比對(duì),從而獲得高精準(zhǔn)定性。通過對(duì)產(chǎn)毒藻、蓄積代謝實(shí)驗(yàn)樣品和實(shí)際陽性樣品綜合分析,共檢出11種AZAs,其中包括AZA-2,3,6,11,12,16,17,28和36,以及AZAs的谷胱甘肽結(jié)合型代謝產(chǎn)物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，目標(biāo)代謝產(chǎn)物檢測(cè)法可無偏差地篩出常規(guī)代謝物,而且對(duì)低濃度代謝產(chǎn)物表現(xiàn)出更佳的響應(yīng)。本方法重現(xiàn)性好,數(shù)據(jù)分析簡(jiǎn)單,對(duì)操作人員的專業(yè)要求不高,更適合AZAs的監(jiān)控要求。

關(guān)鍵詞:液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法;原多甲藻酸毒素;代謝產(chǎn)物;定性分析

貝類毒素具有強(qiáng)毒性和不可預(yù)見性等特點(diǎn),對(duì)消費(fèi)者健康安全和近海生態(tài)造成嚴(yán)重威脅,是國際社會(huì)共同關(guān)注的生態(tài)災(zāi)害和重大海洋環(huán)境問題?，F(xiàn)有8大類貝類毒素中,原多甲藻酸毒素(azaspiracids, AZAs)是最晚發(fā)現(xiàn)的一類新型脂溶性貝類毒素,但這類毒素毒性強(qiáng)、殘留高且代謝慢,因此成為歐盟、美國、加拿大等組織和國家重點(diǎn)關(guān)注的對(duì)象,不僅將其限量標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定為160 μg AZA-1 eq/kg,而且在國際貿(mào)易中重點(diǎn)加以監(jiān)控。在我國,本實(shí)驗(yàn)室在東部沿海城市市售貝類中發(fā)現(xiàn)AZAs的存在[1],隨后又在北黃海養(yǎng)殖蝦夷扇貝中也發(fā)現(xiàn)了這類毒素[2]。顧海峰等[3,4]則證實(shí)了其產(chǎn)毒藻Azadiniumpoporum(A.poporum)廣泛分布于我國近海海域,超過86%的藻株均可產(chǎn)生AZAs,主要毒素為AZA-2,表明AZAs及其產(chǎn)毒藻已對(duì)我國近海生態(tài)和食品安全帶來嚴(yán)重的潛在威脅,必須加以重視。

AZAs被認(rèn)為是已知貝類毒素中風(fēng)險(xiǎn)最大的一種,主要通過蓄積到貝類組織中對(duì)人類健康安全造成威脅[5]。AZAs是現(xiàn)有貝類毒素中毒性較強(qiáng)的一種,人體可觀測(cè)到最小效應(yīng)劑量(LOAEL)為1.9 μg AZA-1 eq/kg b. w.,低于麻痹性貝毒2 μg/kg b. w.的水平[6]。多種貝類對(duì)AZAs的富集能力都極強(qiáng),最高則可達(dá)到8 970 μg/kg,為限量標(biāo)準(zhǔn)的56倍之多[7,8]。比較而言,AZAs在貝類中的消除半衰期則長(zhǎng)達(dá)11天,不僅可長(zhǎng)時(shí)間存在于貝類中,而且消除過程中可代謝成數(shù)十種產(chǎn)物,其毒性和風(fēng)險(xiǎn)性仍不明確[7-10],給消費(fèi)者帶來嚴(yán)重的潛在風(fēng)險(xiǎn)[8]。因此,歐盟擬將貝類中AZAs限量標(biāo)準(zhǔn)下調(diào)到30 μg AZA-1 eq/kg b. w.,并加強(qiáng)對(duì)這類毒素及其代謝物的監(jiān)控[11]。

目前,AZAs快速前處理提取技術(shù)以及高效質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)[12-14]已比較完善,且被用于相關(guān)地區(qū)AZAs污染的監(jiān)控。不過,現(xiàn)有方法檢測(cè)的目標(biāo)物多限于商品化標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)AZA-1,2,3等3種主要組分,雖然這3種組分為歐盟限量規(guī)定的主要目標(biāo),但是缺少AZAs代謝產(chǎn)物的確證方法,嚴(yán)重阻礙了進(jìn)一步開展AZAs代謝產(chǎn)物對(duì)消費(fèi)者健康風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估?，F(xiàn)有研究表明,AZAs經(jīng)食物鏈蓄積到貝類后,可通過氧化、羥基化或脫羧等不同代謝途徑,形成40余種反應(yīng)性代謝產(chǎn)物[7-10]。另外,在乳豬AZA-1,2,3毒素口服暴露試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),腸道內(nèi)容物中除50%是毒素原體外,還有以AZA-8和AZA-10為主的代謝產(chǎn)物,同時(shí)證實(shí)了存在Ⅱ相代謝過程[15]?？梢姶x產(chǎn)物的檢測(cè)也非常有必要,尤其是代謝產(chǎn)物毒性數(shù)據(jù)尚不完善,給消費(fèi)者帶來的安全風(fēng)險(xiǎn)較大。因此,本研究在前期基礎(chǔ)上,進(jìn)一步創(chuàng)建了AZAs的目標(biāo)代謝產(chǎn)物檢測(cè)方法和非目標(biāo)多離子檢測(cè)方法,并通過對(duì)產(chǎn)毒藻、蓄積代謝試驗(yàn)樣品和實(shí)際陽性樣品的綜合分析,明確了AZAs在貝類中蓄積代謝的主要途徑及代謝產(chǎn)物,為進(jìn)一步完善我國水產(chǎn)品中貝類毒素的監(jiān)控體系提供可靠的工作基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

Prominence UFLC超快速液相色譜(Shimadzu公司); 5500 QTRAP四極桿-線性離子阱復(fù)合質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)(SCIEX公司)，配電噴霧離子(electrospray ionization, ESI)源;T18 basic均質(zhì)機(jī)(IKA公司); XW-80 A旋渦混合器(上海醫(yī)大儀器廠); Himac CR 22GⅡ高速離心機(jī)(HITACHI公司); N-EVAP112氮吹儀(Organomation公司); Milli-Q超純水儀(Millipore公司); JY92-IIN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

標(biāo)準(zhǔn)品azaspiracid-1(CRM-AZA1, (1.24±0.07) g/mL)、azaspiracid-2(CRM-AZA2, (1.28±0.05) g/mL)、azaspiracid-3(CRM-AZA3, (1.04±0.04) g/mL)購自加拿大國家研究理事會(huì)海洋生物科學(xué)研究所(CRM);甲醇、乙腈(HPLC級(jí),Merck公司);甲酸(HPLC級(jí),Fluka公司);超純水(18. 2 MΩ5cm),其他未作特殊說明的試劑均為分析純。

1.2樣品處理方法

產(chǎn)毒藻收集及毒素提取:AZAs產(chǎn)毒藻(A.poporum, AZDY06株)由國家海洋局三所顧海峰老師提供,該藻所產(chǎn)毒素種類為AZA-2。實(shí)驗(yàn)室條件下f/2-Si培養(yǎng)液培養(yǎng),溫度20 ℃,光照強(qiáng)度60%,光暗比12 h∶12 h。玻璃纖維濾膜收集指數(shù)期(>107cells/L)藻細(xì)胞,置于2 mL離心管中,加入丙酮1mL溶解,超聲破碎細(xì)胞15 min,強(qiáng)度20%,間隔0.2 s/次。然后用10 kDa超濾離心管超濾離心1 min(1 000×g),收集上清液以待分析。

蓄積實(shí)驗(yàn)及試驗(yàn)樣品處理:24只櫛孔扇貝((67±8) mm)于2015年4月購自青島金海灣養(yǎng)殖合作社,不間斷充氧條件下運(yùn)入實(shí)驗(yàn)室,暫養(yǎng)48 h后用于蓄積實(shí)驗(yàn)。18只扇貝暴露于指數(shù)期藻液稀釋液(50 000 cells/L)中作為實(shí)驗(yàn)組,6只扇貝作為空白對(duì)照組,共持續(xù)12 h,暴露過程中不投喂任何餌料。暴露試驗(yàn)結(jié)束后,分離扇貝肌肉組織及消化腺,均質(zhì)后冷藏于-18 ℃。

實(shí)際陽性樣品為采自福建省福州市水產(chǎn)品市場(chǎng)的市售櫛孔扇貝,經(jīng)檢測(cè)濃度為40 μg AZA-2 eq/kg[2]。

樣品前處理參考實(shí)驗(yàn)室已有方法[2]。概述如下:稱取(2.00±0.02) g樣品,分別用3 mL甲醇提取3次,離心后合并上清液,于40 ℃氮吹至約1 mL,加入3 mL超純水待凈化。依次用1 mL甲醇、1 mL 30%(v/v)甲醇水溶液活化StrataTM-X固相萃取柱(60 mg/3 mL),然后加入提取液,再用1 mL 20%(v/v)甲醇水溶液淋洗,最后用1 mL 0.3%(v/v)氨水甲醇溶液洗脫,收集洗脫液,用甲醇定容至1 mL,過0.22 μm濾膜,上機(jī)分析。

1.3超快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析條件

液相色譜條件:Kinetex XB-C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 2. 6 μm);柱溫:40 ℃;流速:0. 30 mL/min;進(jìn)樣量:5 μL;流動(dòng)相:A為0.15%(v/v)甲酸水溶液,B為乙腈。洗脫梯度:0～7.0 min, 20%B～90%B; 90%B持續(xù)3 min; 10.0～10.1 min, 90%B～20%B; 20%B持續(xù)1 min。

質(zhì)譜條件:電噴霧離子源,負(fù)離子模式;噴霧電壓:4.5 kV;氣簾氣壓力:0. 24 MPa;碰撞氣壓力:0. 02 MPa;溫度:550 ℃;碰撞室入口電壓:10 V;碰撞室出口電壓:12 V;離子源Gas 1: 0. 34 MPa; Gas 2: 0. 34 MPa。其他參數(shù)見表1。

表 1　　　原多甲藻酸毒素的質(zhì)譜分析參數(shù)

目標(biāo)代謝產(chǎn)物檢測(cè)法(predictive multiple reaction monitoring-information-dependent acquisition-enhanced product ion,pMRM-IDA-EPI):根據(jù)AZA-2的結(jié)構(gòu)及質(zhì)譜裂解規(guī)律,基于其常見和已知的I相和Ⅱ相生物轉(zhuǎn)化途徑,預(yù)測(cè)44種代謝反應(yīng)的代謝產(chǎn)物的理論pMRM離子對(duì),設(shè)置相應(yīng)的IDA條件(掃描范圍m/z428～1 250,閾值1 000 cps)以觸發(fā)增強(qiáng)型子離子掃描(EPI)。獲得代謝物的二級(jí)子離子全掃描譜圖,代謝物結(jié)構(gòu)解析應(yīng)用MS Fragmenter軟件完成,同時(shí)比對(duì)代謝物與母體的二級(jí)質(zhì)譜,對(duì)代謝物進(jìn)一步確認(rèn)。

非目標(biāo)多離子檢測(cè)法(multiple ion monitoring-enhance resolution-information-dependent acquisition-enhanced product ion, MIM-ER-IDA-EPI):以m/z806～1 206為掃描范圍,Q1和Q3設(shè)置相同的質(zhì)荷比,共監(jiān)測(cè)401對(duì)離子對(duì)。Q2碰撞能設(shè)置為5 V,避免母離子破碎,駐留/停頓時(shí)間設(shè)為1 ms, CXP 15。

2結(jié)果與討論

2.1原多甲藻酸毒素質(zhì)譜譜庫的建立

AZAs是一種具有6,5,6-三螺環(huán)和環(huán)胺結(jié)構(gòu)的親脂性聚醚類海洋生物毒素(見圖1)。產(chǎn)毒藻中的AZAs毒素主要以AZA-1,2,3的形式存在,經(jīng)雙殼貝類攝食代謝后產(chǎn)生一系列代謝產(chǎn)物。

圖 1　　　AZAs毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig. 1　　　Chemical structure of azaspiracids

AZAs在ESI源電離模式下,所帶電荷位于分析結(jié)構(gòu)末端,產(chǎn)生的碎片離子是末端脫離的小分子或者大分子結(jié)構(gòu)。因此,在碰撞誘導(dǎo)解離(collision-induced dissociation, CID)模式下,多采用分子離子的脫水峰作為特征離子。AZAs分子電離產(chǎn)生的最小結(jié)構(gòu)離子碎片為發(fā)生RDA (Retro-Diels-Alder)反應(yīng)的A環(huán)斷裂。AZAs的二級(jí)碎片離子主要包括:[M+H]+、[M+H-nH2O]+、[M+H-H2O-C9H10O2R1R3]+。按擬定實(shí)驗(yàn)方法對(duì)加標(biāo)扇貝樣品進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè),3種毒素的二級(jí)質(zhì)譜中存在的特征離子包括m/z672 (AZA-3,m/z658)、m/z462 (AZA-3,m/z448)和m/z362等,主要碎片及其豐度見表2,而分離自我國海域的AZAs產(chǎn)毒藻中,其二級(jí)質(zhì)譜中發(fā)現(xiàn)了m/z348[4],存在結(jié)構(gòu)差異。

譜庫即以標(biāo)準(zhǔn)品為樣品,分別建立并儲(chǔ)存碰撞能為20、35、50和(35±15) eV時(shí)的二級(jí)質(zhì)譜圖。通過調(diào)節(jié)Q2中的碰撞能量獲得豐富的碎片,然后對(duì)其主要碎片做MS3,歸屬碎片來源,確定化合物結(jié)構(gòu)。在實(shí)際樣品檢測(cè)過程中,將所獲得的EPI譜圖與譜庫中該化合物的譜圖匹配,當(dāng)匹配值(Fit值)超過85時(shí),為確證分析的有效判據(jù)。當(dāng)Fit值小于50時(shí)可判為陰性。

表 2　　　譜庫中AZAs主要碎片及其豐度

CE: (35±15) eV.

2.2原多甲藻酸毒素代謝產(chǎn)物質(zhì)譜分析方法的建立

AZAs分子結(jié)構(gòu)中的C3和C23是主要的羥基化位點(diǎn),C8和C22為主要的甲基化位點(diǎn)(見圖1),另外還有羧基化代謝產(chǎn)物[16]。根據(jù)上述已知的生物轉(zhuǎn)化途徑,通過預(yù)測(cè)代謝產(chǎn)物的pMRM進(jìn)行代謝產(chǎn)物篩查。為了同時(shí)實(shí)現(xiàn)定性和定量的要求,本研究采用了pMRM-IDA-EPI模式,利用QTrap的線性離子阱功能在MRM獲得化合物的保留時(shí)間、峰面積、離子比率等信息的同時(shí),通過EPI掃描獲得MS/MS圖譜,以代謝產(chǎn)物中的碎片離子比對(duì)譜庫與碎裂規(guī)律進(jìn)行定性分析。為了防止丟失不可預(yù)測(cè)的非常規(guī)代謝產(chǎn)物,同時(shí)建立了MIM-ER-IDA-EPI方法,以達(dá)到同時(shí)檢測(cè)常規(guī)和非常規(guī)代謝產(chǎn)物的目的。

由于生物體內(nèi)的基質(zhì)復(fù)雜且自然環(huán)境下暴露樣品中代謝產(chǎn)物的含量低,因此獲得優(yōu)秀的靈敏度和精確度對(duì)于代謝產(chǎn)物的篩查更為重要。對(duì)比兩種檢測(cè)方法所獲得的譜圖(見圖2), MIM-ER-IDA-EPI方法達(dá)到了更寬的掃描范圍,因此對(duì)其數(shù)據(jù)的分析和后處理較為復(fù)雜。同時(shí),pMRM-IDA-EPI根據(jù)AZAs的主要代謝反應(yīng)預(yù)測(cè)的44種常規(guī)代謝產(chǎn)物,可以檢測(cè)到主要的代謝產(chǎn)物并進(jìn)行確證分析,且對(duì)低濃度代謝產(chǎn)物響應(yīng)更優(yōu)。因此,比較而言,pMRM-IDA-EPI方法滿足代謝產(chǎn)物篩查需求,重現(xiàn)性好,數(shù)據(jù)分析簡(jiǎn)單,對(duì)操作人員專業(yè)要求不高,更適用于日常毒素監(jiān)控要求。

圖 2　　　蓄積代謝樣品非目標(biāo)多離子檢測(cè)法與目標(biāo)代謝　　　產(chǎn)物檢測(cè)法總離子流圖Fig. 2　　　Total ion chromatograms of exposure test sample　　　with multiple ion monitoring-enhance resolution-information-dependent acquisition-enhanced product ion (MIM-ER-IDA-EPI) and predictive multiple reaction monitoring-information-dependent acquisition-enhanced product ion (pMRM-IDA-EPI) methods

2.3實(shí)際樣品的分析

應(yīng)用上述檢測(cè)方法檢測(cè)產(chǎn)毒藻、蓄積代謝實(shí)驗(yàn)樣品和實(shí)際陽性樣品中的原多甲藻酸毒素及其代謝產(chǎn)物。結(jié)果發(fā)現(xiàn),蓄積代謝試驗(yàn)樣品櫛孔扇貝中的AZAs及其代謝產(chǎn)物主要有AZA-2,3,6,11,12,16,17,28,36以及1種AZAs的谷胱甘肽結(jié)合型代謝產(chǎn)物,其中羥基化、甲基化、羧基化為主要的代謝方式。本方法中應(yīng)用pMRM-IDA-EPI結(jié)合的方式進(jìn)行的定性具有更高的可信度,色譜及質(zhì)譜離子碎片信息見圖3。研究中在蓄積實(shí)驗(yàn)樣品和實(shí)際陽性樣品中均檢測(cè)到少量谷胱甘肽結(jié)合物。初篩出的代謝產(chǎn)物類型及代謝途徑見表3。

以AZA-1標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算除AZA-2和AZA-3外的其他代謝產(chǎn)物含量,AZA-2和AZA-3用各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線定量,結(jié)果以μg AZA-1 eq/kg折算,其中AZA-1、AZA-2、AZA-3的毒力當(dāng)量因子分別為1.0、1.8、1.4,其他物質(zhì)的毒力當(dāng)量因子以1.0計(jì)。產(chǎn)毒藻毒素含量最高,為530 μg AZA-1 eq/kg;蓄積實(shí)驗(yàn)消化腺樣品貝類毒素次之,為(320±20) μg AZA-1 eq/kg;肌肉組織樣品與實(shí)際陽性樣品中毒素含量較低。應(yīng)用代謝產(chǎn)物研究方法所獲得AZA-2的EPI匹配譜庫Fit值>89, AZA-3的EPI匹配譜庫Fit值>86,證明了方法有效性。其中蓄積代謝實(shí)驗(yàn)消化腺樣品代謝產(chǎn)物含量占比8.70%,實(shí)際陽性樣品代謝產(chǎn)物含量占比為16.4%。

圖 3　　　原多甲藻酸毒素代謝產(chǎn)物的增強(qiáng)子離子掃描譜圖Fig. 3　　　EPI chromatograms of azaspiracid metabolites　a. M44 (m/z 842.5); b. parent (m/z 856.5); c. M8 (m/z 838.2); d. M6 (m/z 870.4); e. M32 (m/z 888.4); f. M2 (m/z 858.5); g. M25 (m/z 936.6); h. M77 (m/z 828.5); i. M18 (m/z 1143.5).　For peak IDs, see Table 3.

PeakIDinFig.4BiotransformationQ1/Q3(m/z)Retentiontime/minAZASourceofsampleParent856.5/838.45.36AZA-2toxinproducingalgae,exposuretestsample,AZAspositiveshellfishM6-H2O+2O870.4/852.55.54AZA-11,12,17toxinproducingalgae,exposuretestsample,AZAspositiveshellfishM2-CH2+O858.5/348.25.74AZA-36toxinproducingalgae,exposuretestsampleM8-H2O838.2/820.35.37AZA-28exposuretestsampleM32+2O888.4/870.53.92AZA-16exposuretestsampleM44-CH2842.5/824.57.38AZA-6exposuretestsampleM25+2C2H2O936.6/918.46.94-exposuretestsampleM77-2CH2828.54.65AZA-3exposuretestsampleM18+glutathione-H2O1143.5/1143.59.73-exposuretestsample,AZAspositiveshellfish

由于EPI只能獲得m/z1 000以下的離子碎片,需要進(jìn)一步完善谷胱甘肽型結(jié)合代謝產(chǎn)物定性方法,如采用中性丟失的方式。貝類樣品基質(zhì)復(fù)雜且所含貝類毒素尤其是代謝產(chǎn)物含量低,因此所獲得的EPI譜圖主要以母離子和脫水離子峰為主作為毒素定性依據(jù)(見圖3),但無法清晰地看到A環(huán)、C19-C20和E環(huán)的碎裂片段。如需完成結(jié)構(gòu)分析,仍需純化后結(jié)合核磁共振數(shù)據(jù)。

3結(jié)論

本方法采用三重四極桿復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜儀,建立了原多甲藻酸毒素及其代謝產(chǎn)物的pMRM-IDA-EPI和MIM-ER-IDA-EPI方法,分別對(duì)產(chǎn)毒藻、蓄積代謝實(shí)驗(yàn)樣品和實(shí)際陽性樣品進(jìn)行代謝產(chǎn)物分析。結(jié)果表明,pMRM檢測(cè)方法從候選代謝物中無偏差地找到常規(guī)代謝物,滿足代謝產(chǎn)物需求,且低濃度代謝產(chǎn)物響應(yīng)更優(yōu)。除原毒素AZA-2外,共發(fā)現(xiàn)10種代謝產(chǎn)物,包括AZA-3,6,11,12,16,17,28,36以及1種AZAs的谷胱甘肽結(jié)合型代謝產(chǎn)物。羥基化、甲基化、羧基化為主要的生物代謝途徑。

產(chǎn)毒藻經(jīng)過貝類的蓄積作用進(jìn)入食物鏈,給消費(fèi)者帶來極大的食用安全風(fēng)險(xiǎn)。由于目前缺乏系統(tǒng)的監(jiān)控計(jì)劃,我國的鮮活貝類產(chǎn)品對(duì)歐美國家的出口已全面停止,成為制約產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵瓶頸。同時(shí),消費(fèi)者因攝入污染貝類中毒事件時(shí)有發(fā)生,其中2011年浙江地區(qū)發(fā)生了200余人的腹瀉性貝類毒素中毒事件[17]。尤其是分離自我國的原多甲藻A.poporum已被證實(shí)產(chǎn)生多種AZAs且在整個(gè)海岸線均有分布[3],且主要毒素為AZA-2,其毒素當(dāng)量因子為1.8,毒性較AZA-1更強(qiáng),因此加強(qiáng)貝類安全監(jiān)管已迫在眉睫。

目前國際上關(guān)注的AZAs產(chǎn)毒藻主要是A.spinosum,我國海域分布的AZAs產(chǎn)毒藻主要為A.poporum,且貝類體內(nèi)代謝產(chǎn)物存在獨(dú)特的“m/z348”碎片。為了明確該產(chǎn)毒藻的產(chǎn)毒特性,亟需開展AZAs在貝類體內(nèi)的消除代謝規(guī)律研究,這對(duì)于確保我國消費(fèi)者安全和貝類產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展具有重要意義。

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Liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis for azaspiracids and their metabolites

WU Haiyan1,2, GUO Mengmeng1,2, ZHAO Chunxia1,2, TAN Zhijun1,2*,GU Haifeng3, ZHAI Yuxiu1,2, LU Lina1,2

(1. Key Laboratory of Testing and Evaluation for Aquatic Product Safety and Quality, Ministry of Agriculture,China; Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071,China;2. Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Aquatic Products (Qingdao),Ministry of Agriculture, Qingdao 266071, China; 3. Third Institute of Oceanography,State Oceanic Administration, Xiamen 361000, China)

Abstract:A liquid chromatography-tandem mass spectrometry method was developed for the analysis of azaspiracids and their metabolites. Both target metabolites and non-objective compounds detection methods were investigated, and the secondary mass spectra were compared with the standard spectra libraries to achieve high precision qualitative analysis. As a result, 11 metabolites including AZA-2, 3, 6, 11, 12, 16, 17, 28 and 36, as well as the glutathione conjugated metabolites of AZAs were analyzed in toxin-producing algae, accumulated samples of metabolic experiments and positive samples. Conventional metabolites were unbiased detected by target metabolites detection method, and showed a better response to low concentration metabolites. The method has excellent reproducibility, and is easy for operators. It can be used for the routine monitoring of AZAs.

Key words:liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS); azaspiracids (AZAs); metabolites; qualitative analysis

中圖分類號(hào):O658

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1000-8713(2016)04-0401-06

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(41106109);中央級(jí)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目(20603022011004,20603022015017-2).

*收稿日期:2015-11-26

DOI:10.3724/SP.J.1123.2015.11043

*通訊聯(lián)系人.Tel:(0532)85826348,E-mail:tanzj@ysfri.ac.cn.

Foundation item: National Natural Science Foundation of China (No. 41106109); Special Funds for the Basic R & D Program in the Central Non-Profit Research Institutes (Nos. 20603022011004, 20603022015017-2).