李曉敏　張萍萍　陳澤娜　曹雙燕　魏秋靜　古潔若

510630 廣州，中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院風(fēng)濕免疫科

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中國(guó)南方地區(qū)體檢人群rs9263726等位基因頻率的分析

李曉敏張萍萍陳澤娜曹雙燕魏秋靜古潔若

510630 廣州，中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院風(fēng)濕免疫科

【摘要】目的了解中國(guó)南方地區(qū)體檢人群?jiǎn)魏塑账岫鄳B(tài)性(SNP)rs9263726位點(diǎn)等位基因頻率。方法納入中國(guó)南方地區(qū)191名健康體檢者，從全血中提取DNA，采用Sanger測(cè)序法對(duì)所有DNA樣本進(jìn)行檢測(cè)，分析rs9263726位點(diǎn)等位基因頻率。結(jié)果rs9263726 位點(diǎn)突變純合子AA基因型頻率為1.57%，野生純合子 GG、突變雜合子GA的基因型頻率分別為87.43%、10.99%，A等位基因攜帶率為12.57%，頻率為7.07%。GG分型者的年齡及性別與GA及AA者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論中國(guó)南方地區(qū)健康體檢者rs9263726位點(diǎn)存在突變，該突變無(wú)年齡、性別傾向性。

【關(guān)鍵詞】rs9263726；基因頻率

別嘌醇是黃嘌呤氧化酶的抑制劑，可阻止次黃嘌呤和黃嘌呤代謝為尿酸，減少尿酸的生成，是治療痛風(fēng)的首選藥。隨著藥物的大量使用，其不良反應(yīng)日益突出，主要是與用藥相關(guān)的藥疹情況。別嘌醇可引起中毒性表皮壞死松解癥(TEN)、重癥滲出性多形紅斑藥疹(SJS)及藥物超敏綜合征(HSS)等嚴(yán)重皮膚不良反應(yīng)(SCAR)，發(fā)生率約5%，致死率高[1]。2005年Hung等[2]首次發(fā)現(xiàn)臺(tái)灣漢族人群HLA-B*58∶01等位基因與別嘌醇引起SCAR強(qiáng)相關(guān)。在中國(guó)大陸漢族人群中也隨后發(fā)現(xiàn)這種相關(guān)性，并且輕微型和嚴(yán)重型皮膚不良反應(yīng)與HLA-B*58∶01均呈強(qiáng)相關(guān)[3]。但是，由于HLA分型技術(shù)及基因本身的復(fù)雜性等原因，難以在臨床檢測(cè)中普及。日本研究者Tohkin等[4]發(fā)現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性(SNP)rs9263726位點(diǎn)A等位基因與別嘌醇引起SCAR相關(guān)，并與HLA-B*58∶01呈完全連鎖不平衡。因此，rs9263726 A等位基因期望能代替HLA-B*58∶01，成為別嘌醇致SCAR的預(yù)測(cè)因子，并指導(dǎo)痛風(fēng)患者的用藥，而目前國(guó)內(nèi)相關(guān)研究較少。為此，本研究檢測(cè)南方地區(qū)漢族體檢人群SNP rs9263726等位基因頻率，并探討其與性別、年齡的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)告如下。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

2013年在我院收集191名籍貫為南方地區(qū)的漢族健康體檢者，男107名，女84名，年齡(46.6±10.2)歲，來(lái)自廣東143名，其他地區(qū)48名。入組對(duì)象血清尿酸水平均正常。

二、方法

1. 標(biāo)本采集及資料收集

采集所有入組對(duì)象的靜脈血檢測(cè)rs9263726位點(diǎn)等位基因，同時(shí)記錄研究對(duì)象的樣本編號(hào)、性別、年齡、籍貫等資料。入組患者均已簽署知情同意書(shū)。

2. rs9263726等位基因的檢測(cè)

以鹽析法提取DNA，采用Sanger測(cè)序法對(duì)所有DNA樣本進(jìn)行檢測(cè)。將提取所得模板DNA行PCR擴(kuò)增。rs9263726序列來(lái)自GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)。應(yīng)用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物，由達(dá)安基因公司合成。引物序列如下：上游5’-ACCCCACTAGCTTTGTCCTC-3’；下游 5’-GTCCTTTGCC TGCACACCA-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度為370 bp。反應(yīng)體系50 μl：模板DNA 10 μl，5倍緩沖液10 μl，5 mmol/L Betain(Sigma，美國(guó))8 μl，2.5 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸(Promega，美國(guó)) 0.5 μl，10 μmol/L 上游引物 1 μl，10 μmol/L下游引物 0.3 μl，Taq熱啟動(dòng)酶(Sigma，美國(guó))0.4 μl，重蒸水19.8 μl。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?0℃ 預(yù)變性3 min，95℃變性15 min，94℃變性30 s，55℃維持40 s，72℃延伸40 s，共45個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物交由蘇州金唯智測(cè)序公司測(cè)序，用ABI 3730xl DNA分析儀的毛細(xì)管電泳和熒光染料終止技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行分析。使用生物編輯序列校準(zhǔn)編輯器查看測(cè)序峰圖。測(cè)序圖底峰不高，信號(hào)較均一，無(wú)衰減信號(hào)，并與美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)比對(duì)確認(rèn)目的序列。分析SNP rs9263726位點(diǎn)等位基因分型及頻率，并總結(jié)其他亞洲人群rs9263726(G>A)的相關(guān)研究結(jié)果。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果

一、南方地區(qū)健康體檢人群SNP rs9263726位點(diǎn)基因型確定

191例標(biāo)本測(cè)序結(jié)果如圖1所示，野生型(GG)及突變型純合子(AA)表現(xiàn)為單一峰，雜合型表現(xiàn)為套峰(AG)。

圖1　rs9263726多態(tài)性位點(diǎn)測(cè)序分型測(cè)序峰圖

A：rs9263726的GG野生型；B：rs9263726的GA突變雜合子；C：rs9263726的AA突變純合子

二、南方地區(qū)健康體檢人群rs9263726的基因型分布

191例標(biāo)本中，GG基因型167例，頻率為87.43%；GA基因型21例，頻率為10.99%；AA基因型3例，頻率為1.57%。G為優(yōu)勢(shì)等位基因，等位基因頻率為92.93%(359/382)，攜帶率為98.43(188/191)；A的等位基因頻率為7.07%(6/382)，攜帶率 12.57%(24/191)?；蛐皖l率分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡(χ2=5.079，P=0.079)。

三、南方地區(qū)健康體檢人群中rs9263726不同等位基因分型者的年齡、性別比較

因GA及AA分型較少，故將其合并計(jì)算，結(jié)果示rs9263726位點(diǎn)GG分型者的年齡及性別與GA及AA者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.060，P=0.953；χ2=0.038，P=0.845)，見(jiàn)表1。

表1　　　南方地區(qū)健康體檢人群

四、中國(guó)南方地區(qū)與其他亞洲人群rs9263726(G>A)的基因頻率分析

目前對(duì)rs9263726的研究較少，且多為地區(qū)性的小群體研究， 其他亞洲人群的rs9263726(G>A)相關(guān)研究結(jié)果見(jiàn)表2。

表2

國(guó)內(nèi)外健康志愿者

注：ars9263726-A等位基因攜帶率；b本研究數(shù)據(jù)

討論

自2005年Hung[2]等首次報(bào)道中國(guó)臺(tái)灣漢族人51個(gè)別嘌醇致SCAR患者均攜帶HLA-B*58∶01基因后，陸續(xù)在多個(gè)國(guó)家包括中國(guó)香港和大陸等地區(qū)也發(fā)現(xiàn)HLA-B*58∶01與服用別嘌醇致SCAR強(qiáng)相關(guān)[3,7]。攜帶HLA-B*58∶01等位基因的中國(guó)漢族患者服用別嘌醇發(fā)生皮膚過(guò)敏反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)較未攜帶此基因型的漢族人群風(fēng)險(xiǎn)比增加339倍[3]。在中國(guó)，痛風(fēng)的患病率為0.15%~1.98%，而使用別嘌呤醇治療的患者中發(fā)生HSS大約為1∶260(0.4%)，SCAR發(fā)病率和致死率增加，病死率可高達(dá)26%[8]。

2012年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)痛風(fēng)指南指出中國(guó)漢族人和泰國(guó)人應(yīng)用別嘌醇前應(yīng)行HLA-B*58∶01等位基因檢測(cè)[9]。但由于HLA分型的血清學(xué)分型和基因分型各有不足，難以在臨床工作中廣泛開(kāi)展。尋找替代的分子遺傳標(biāo)志物成為研究重點(diǎn)。

最近一項(xiàng)中國(guó)漢族人群的HLA-B等位基因的藥物反應(yīng)和疾病風(fēng)險(xiǎn)的標(biāo)簽SNP研究中，發(fā)現(xiàn)7個(gè)SNP位點(diǎn)可標(biāo)記HLA-B*58∶01，其中的rs9262570(C>T)T等位基因標(biāo)記HLA-B*58∶01的敏感度和陰性預(yù)測(cè)值均為100%，但其陽(yáng)性預(yù)測(cè)值較低，僅76.4%，未能排除假陽(yáng)性情況[10]。

日本的全基因組關(guān)聯(lián)分析研究納入14例別嘌醇SJS/TEN患者和991名健康人，也提示了HLA-B*58∶01和別嘌醇相關(guān)SCAR密切相關(guān)(OR=62.8，P<0.001)[4]。該研究也發(fā)現(xiàn)其他幾個(gè)分別位于BAT1、HCP5、MICC和PSORS1C1基因的SNP與別嘌醇相關(guān)的SJS或TEN有關(guān)(OR>61，P<0.001)。在206例日本個(gè)體分析顯示，位于PSORS1C1 基因rs9263726的SNP與HLA-B*58∶01呈完全連鎖不平衡(r2=1.000，D’=1.000)。提示rs9263726(G>A)可作為預(yù)測(cè)日本人群發(fā)生別嘌醇致SJS/TEN的分子標(biāo)志物。隨后的研究采用PCR-RFLP法檢測(cè)rs92637263種基因型，發(fā)現(xiàn)在日本的美籍華人rs9263726位點(diǎn)A等位基因頻率為0.105，遠(yuǎn)高于當(dāng)?shù)厝毡救巳篬5]。最近，一項(xiàng)中國(guó)人群rs9263726(G>A)A等位基因替代HLA-B*58∶01作為預(yù)測(cè)別嘌呤醇致SCAR發(fā)生分子標(biāo)志物的可行性研究發(fā)現(xiàn)，HLA-B*58∶01和PSORS1C1 rs9263726(G>A)多態(tài)位點(diǎn)間呈強(qiáng)連鎖不平衡(r2=0.902，D’=0.966)。rs9263726(G>A) A等位基因用于預(yù)測(cè)該人群別嘌呤醇致SCAR發(fā)生的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為91.30%、88.89%、90.32%和90.00%，提示診斷效能良好[6]。

本研究發(fā)現(xiàn)在中國(guó)南方地區(qū)健康體檢人群中，rs9263726(G>A)AA突變純合子攜帶率為1.57%，A等位基因頻率達(dá)7.07%。在ENSEMBL網(wǎng)頁(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索到的千人基因組計(jì)劃中，北京漢族人rs9263726位點(diǎn)A等位基因頻率為0.087(18例)；而南方漢族人等位基因頻率為0.062(13例)，遠(yuǎn)高于日本人群的等位基因頻率0.014(3例)，且與本研究結(jié)果相符合。在Allefrequencies數(shù)據(jù)庫(kù)搜索到中國(guó)南方漢族人HLA-B*58∶01的等位基因頻率為0.089(284例)，與rs9263726位點(diǎn)A等位基因頻率相近。本研究中，野生型和突變型純合子與雜合子比例在性別上無(wú)差異，提示該位點(diǎn)突變無(wú)性別傾向性。

目前rs9263726(G>A)與HLA-B*58∶01的關(guān)聯(lián)分析尚少，樣本量不大。若rs9263726 位點(diǎn)A等位基因與HLA-B*58∶01的連鎖不平衡關(guān)系在其他人群也能得到證實(shí)，那么，相對(duì)易分型的rs9263726(G>A)A等位基因可望成為臨床預(yù)測(cè)別嘌醇致SCAR風(fēng)險(xiǎn)的替代分子遺傳標(biāo)志物。

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(本文編輯：林燕薇)

Analysis of allele frequency of rs9263726 in physical examination population from South China

LiXiaomin，ZhangPingping,ChenZena,CaoShuangyan,WeiQiujing,GuJieruo.

RheumaticDepartment，theThirdAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity，Guangzhou510630,ChinaCorrespondingauthor,GuJieruo，E-mail：gujieruo@163.com

【Abstract】ObjectiveTo investigate the allele frequency of single nucleotide polymorphism (SNP) rs9263726 in the physical examination population from South China. MethodsIn this study, 191 healthy individuals receiving physical examination were enrolled. DNA sample was extracted from the whole blood and subject to Sanger sequencing to detect the allele frequency of rs9263726. ResultsThe allele frequency of variant homozygote A/A at rs9263726 was 1.57%, 87.43% for wild homozygote G/G, 10.99% for mutant heterozygote G/A. The allele frequency of A was 7.07%, and 12.57% for carrier frequency of A. Age and gender did not significantly differ between the individuals carrying G/G and their counterparts carrying G/A or A/A (both P>0.05). ConclusionsThe mutation of allele frequency of rs9263726 was observed in the physical examination population from South China. This mutation had no age or gender preponderance.

【Key words】rs9263726; Allele Frequency

(收稿日期：2015-11-20)

通訊作者，古潔若，E-mail：gujieruo@163.com

DOI：10.3969/j.issn.0253-9802.2016.03.003

·基礎(chǔ)研究論著·