郭冰玉，張婷婷，蘇靜緣，王凱文，李曉明

氧化苦參堿與奈達(dá)鉑聯(lián)用對(duì)人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87 MG細(xì)胞增殖的影響

郭冰玉，張婷婷，蘇靜緣，王凱文，李曉明*

[摘要]目的觀察氧化苦參堿與奈達(dá)鉑聯(lián)用抑制人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87 MG細(xì)胞增殖的效果。方法將傳代的U87 MG細(xì)胞分為對(duì)照組、奈達(dá)鉑單藥處理組(NDP組)、氧化苦參堿單藥處理組(OXY組)和兩種藥物聯(lián)合處理組(聯(lián)合組)，分別在不同時(shí)間點(diǎn)，使用不同濃度的藥物，用MTT方法檢測(cè)U87 MG細(xì)胞光密度值(OD490)，觀察細(xì)胞增殖情況；用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同處理對(duì)各組細(xì)胞周期的作用。結(jié)果對(duì)細(xì)胞處理48 h 后，OXY組、NDP組及聯(lián)合組U87 MG細(xì)胞的增殖抑制率分別為18.74%±2.66%、27.66%±0.87%、75.87%±1.19%。兩種藥物聯(lián)合使用對(duì)U87 MG細(xì)胞的抑制作用顯著高于各單藥組相同劑量藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率，各組抑制率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。對(duì)照組、OXY組、NDP組、聯(lián)合組細(xì)胞周期G1期的百分比分別為67.81%±0.55%、71.87%±1.64%、78.01%±2.06%、84.75%±0.72%。兩藥聯(lián)合應(yīng)用對(duì)細(xì)胞G1期的阻滯作用增強(qiáng)，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論氧化苦參堿與奈達(dá)鉑聯(lián)合使用對(duì)抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖有協(xié)同效果，可以降低奈達(dá)鉑的使用濃度，進(jìn)而減輕治療時(shí)化療藥物的毒副作用。

[關(guān)鍵詞]氧化苦參堿；奈達(dá)鉑；U87 MG；膠質(zhì)母細(xì)胞瘤

[Abstract]ObjectiveTo observe the effect of oxymatrine combined with nedaplatin on the proliferation of human glioblastoma U87 MG cells.MethodsU87 MG cells were divided into control group,nedaplatin treatment group (NDP group),oxymatrine treatment group (OXY group) and nedaplatin combined with oxymatrine treatment group (combination group).The proliferation rate of U87 MG cells at different time points treated by different concentrations of drugs were tested by MTT and the cells cycle was tested by flow cytometry.ResultsThe inhibition rate of cell proliferation in OXY group,NDP group and combination group were 18.74%±2.66%,27.66%±0.87% and 75.87%±1.19% after 48 h.The inhibition rate in combination group was higher than those of single drug groups,and there were significant differences among the groups (P<0.01).The percentages of cells in G1phase of cell cycle in control group,OXY group,NDP group and combination group were 67.81%±0.55%,71.87%±1.64%,78.01%±2.06% and 84.75%±0.72%.ConclusionOxymatrine combined with nedaplatin has synergistic effects on the inhibition of the proliferation of glioblastoma cells,it can reduce the concentration of and reduce the side effects of nedaplatin.

doi[1]Hiroyuki M,Ogino J,Takahashi A,et al.Rhabd glioblastoma:an aggressive variaty of astrocytic tumor[J].Nagoya J Med Sci,2015,77(1-2):321-328. 10.14053/j.cnki.ppcr.201512003

收稿日期：2015-10-09

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(81171793);盛京自由研究者計(jì)劃

通信作者*

Effect of oxymatrine combined with nedaplatin on the proliferation of human glioblastoma U87 MG cellsGUO Bing-yu,ZHANG Ting-ting,SU Jing-yuan,WANG Kai-wen,LI Xiao-ming*(Institute of Neurology,General Hospital of Shenyang Military Command,Shenyang 110016,China)

Key words：Oxymatrine;Nedaplatin;U87 MG;Glioblastoma

0引言

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(Glioblastoma multiforme，GBM)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤，其惡性程度和復(fù)發(fā)率極高，患者的中位生存期平均為6~14個(gè)月[1]。目前常規(guī)的治療手段是術(shù)后放化療，以提高患者的生存期。但是由于化療藥物本身的毒副作用以及血腦屏障的影響，使得化療對(duì)該種腫瘤的治療效果達(dá)不到理想的效果[2]。尋找新的藥物及化療方案，減少藥物的毒副作用，對(duì)患者的生存質(zhì)量和生存期具有重要的意義。

氧化苦參堿(Oxymatrine)是苦參的主要有效成分，不僅具有抑制腫瘤的作用[3]，還能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫力[4]，降低放化療毒副反應(yīng)[5]。已有研究表明，氧化苦參堿具有開放血腦屏障的作用[6]，并能夠抑制大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6的增殖[7]。順鉑的同類藥物奈達(dá)鉑(Nedaplatin)在臨床上已用于多種腫瘤的治療。Takakura等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，奈達(dá)鉑在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療上有一定效果。但目前尚未發(fā)現(xiàn)有這兩種藥物聯(lián)合治療膠質(zhì)瘤的報(bào)道。

本研究以人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87 MG細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察氧化苦參堿聯(lián)合奈達(dá)鉑對(duì)U87 MG細(xì)胞增殖的抑制效果，以及對(duì)細(xì)胞周期的阻滯作用，為臨床治療膠質(zhì)瘤提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料與儀器人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87 MG細(xì)胞株(實(shí)驗(yàn)室凍存)，DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen)，胎牛血清(天津?yàn)?，氧化苦參堿(Selleck)，奈達(dá)鉑注射液(輝瑞)，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)，PI染料(碧云天)。酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)Bio-Rad)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)將U87 MG細(xì)胞株用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(含50 IU/mL青霉素，50 IU/mL鏈霉素)培養(yǎng)，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.3藥物處理濃度奈達(dá)鉑為臨床常用的化療藥物，根據(jù)linburg公式 C=20D [C單位為μg/mL，D為臨床劑量單位mg/(kg·d)]和體表面積計(jì)算公式S=1.15+(m-30)×0.1×5-1(其中m>30 kg)計(jì)算出MTT所需藥物濃度，奈達(dá)鉑設(shè)高[10×PPC(Peak plasma concentration)]、中(1×PPC)、低(0.1×PPC) 3個(gè)濃度。氧化苦參堿取10、20、40 μg/mL 3個(gè)濃度?？瞻讓?duì)照組為NaCl處理組。

1.4MTT實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U87 MG細(xì)胞以2×104/mL濃度接種于96孔培養(yǎng)板中，終體積為200 μL，細(xì)胞培養(yǎng)12 h貼壁后更換培養(yǎng)基，加入不同濃度藥物，各劑量組及對(duì)照組(NaCl處理組)分設(shè)3個(gè)復(fù)孔。處理后的細(xì)胞于0、12、24、36、48 h分別加入5 mg/mL MTT溶液10 μL，37 ℃濕潤(rùn)環(huán)境中溫育4 h，棄去孔中的培養(yǎng)基和MTT，在孔中各加入200 μL DMSO，以溶解殘留的MTT-甲臜結(jié)晶，置回37 ℃ CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中。15 min后，立即在490 nm處記錄吸光值。藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率計(jì)算公式：抑制率=1-(劑量組平均OD值/對(duì)照組平均OD值)× 100%。

1.5細(xì)胞周期分析將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U87 MG細(xì)胞用胰酶消化后制成1×106/L濃度的細(xì)胞懸液，接種于6孔板中，貼壁培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度藥物。藥物作用24 h后收集細(xì)胞，PBS洗滌后胰酶消化，制成單細(xì)胞懸液。用70%的冰乙醇4 ℃固定1 h，用PI染液[配方：0.5 mL PI原液(1 mg/mL)，20 μL RNase (10 mg/mL)，0.1 mL TritonX-100(1%)，20 μL EDTA，加PBS至10 mL，調(diào)pH至7.2~7.6]避光染色30 min，用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期。

1.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料比較使用非配對(duì)t檢驗(yàn)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1不同處理對(duì)U87 MG細(xì)胞增殖的影響

2.1.1氧化苦參堿組采用不同濃度的氧化苦參堿分別對(duì)U87 MG細(xì)胞作用0、12、24、36、48 h后，細(xì)胞增殖情況見圖1、表1。結(jié)果顯示，不同濃度的氧化苦參堿均可以抑制U87 MG細(xì)胞的增殖，其細(xì)胞增殖抑制率與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，氧化苦參堿對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用與劑量、作用時(shí)間呈正比關(guān)系。

2.1.2奈達(dá)鉑組采用不同濃度的奈達(dá)鉑分別對(duì)U87 MG細(xì)胞作用0、12、24、36、48 h后，細(xì)胞增殖情況見圖2、表2。結(jié)果顯示，奈達(dá)鉑能夠顯著抑制U87 MG細(xì)胞的增殖，增殖抑制率與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，奈達(dá)鉑對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用與劑量和作用時(shí)間呈正比關(guān)系。

圖1　不同劑量氧化苦參堿作用下U87 MG細(xì)胞的增殖情況

時(shí)間(h)NaCl氧化苦參堿(μg/mL)10204000.00-4.55-2.58-2.77120.0011.55**15.84**23.71**240.0013.20**16.73**26.06**360.0015.88**22.75**34.33**480.0019.44**24.93**35.37**

注：與NaCl組比較，**P<0.01

圖2　不同劑量奈達(dá)鉑作用下U87 MG細(xì)胞的增殖情況

時(shí)間(h)NaCl奈達(dá)鉑(μg/mL)55050000.003.423.453.45120.0012.10**42.43**54.95**240.0021.40**51.66**62.00**360.0023.50**57.09**66.22**480.0027.66**59.91**68.39**

注：與NaCl組比較，**P<0.01

2.1.3氧化苦參堿與奈達(dá)鉑聯(lián)合處理組采用各單藥處理組的最低使用濃度聯(lián)合處理細(xì)胞，見圖3、表3。結(jié)果顯示，5 μg/mL奈達(dá)鉑與10 μg/mL氧化苦參堿聯(lián)合使用對(duì)U87 MG細(xì)胞增殖的抑制有協(xié)同作用，氧化苦參堿能夠顯著提高奈達(dá)鉑對(duì)U87 MG細(xì)胞增殖的抑制作用，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖3　奈達(dá)鉑、氧化苦參堿單獨(dú)使用及聯(lián)合應(yīng)用時(shí)細(xì)胞的增殖情況

時(shí)間(h)NaCl奈達(dá)鉑(5μg/mL)氧化苦參堿(10μg/mL)聯(lián)合組00.003.423.453.45120.0012.10**6.84**56.93**240.0021.40**9.52**68.79**360.0023.50**15.62**71.69**480.0027.66**18.74**75.87**

注：與NaCl組比較，**P<0.01

2.2不同處理對(duì)U87 MG細(xì)胞周期的影響見圖4。不同藥物處理時(shí)，U87 MG細(xì)胞的G1-S期轉(zhuǎn)化受到了不同程度的抑制，其中兩藥聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，細(xì)胞周期G1-S期被阻滯的程度增強(qiáng)。

3討論

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤通常呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，手術(shù)難以徹底清除，患者生存期短，病死率高，5年生存率低于5.5%[9]。術(shù)后化療是治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的重要環(huán)節(jié)，但是由于血腦屏障和耐藥機(jī)制的存在，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的化療效果并不理想[10]。因此，尋找與化療藥物協(xié)同作用的藥物以提高治療效果，對(duì)提高患者生存率具有積極意義。

本研究顯示，低濃度氧化苦參堿(10 μg/mL)與奈達(dá)鉑(0.1×PPC)聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，對(duì)U87 MG細(xì)胞增殖的抑制率高于兩者單獨(dú)使用的抑制率之和，起到了協(xié)同作用的效果。流式分析也顯示當(dāng)氧化苦參堿與奈達(dá)鉑聯(lián)合作用24 h時(shí)細(xì)胞周期G1-S期的阻滯作用增強(qiáng)。推斷氧化苦參堿可以增強(qiáng)奈達(dá)鉑對(duì)U87 MG細(xì)胞增殖的抑制效果。

圖4　不同藥物作用下細(xì)胞周期的變化

氧化苦參堿是傳統(tǒng)中藥苦參的主要生物活性成分，具有廣泛的藥理學(xué)活性，近年來(lái)其抗腫瘤作用受到研究者的關(guān)注。已有研究表明，氧化苦參堿聯(lián)合環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide，CTX)可明顯增強(qiáng)CTX的抗腫瘤效果[11]。對(duì)于HNE-1細(xì)胞，氧化苦參堿可以增強(qiáng)VCR、平陽(yáng)霉素、5-FU的化療效果[12]。劉秀均等[13]也通過(guò)體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，氧化苦參堿與順鉑聯(lián)合作用可以顯著提高順鉑對(duì)肝癌的抑制率。表明氧化苦參堿具有增強(qiáng)化療藥物敏感性的作用。同時(shí)，氧化苦參堿與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用，可以降低化療藥物導(dǎo)致的骨髓抑制，緩解化療引起的胃腸道反應(yīng)，改善患者食欲，減輕疼痛，提高化療耐受性和患者的生存質(zhì)量[14-15]。Zhang等[16]研究證實(shí)，氧化苦參堿可以通過(guò)降低血腦屏障的緊密連接，開放血腦屏障，提高化療藥物進(jìn)入腦組織的比例，因此，氧化苦參堿還可以作為膠質(zhì)瘤化療的輔助藥物。

綜上所述，氧化苦參堿與奈達(dá)鉑聯(lián)合應(yīng)用，可以降低奈達(dá)鉑治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的使用濃度，進(jìn)而減少奈達(dá)鉑化療的毒副作用，對(duì)提高膠質(zhì)瘤的治療效果有一定的意義，是一種極具優(yōu)勢(shì)和潛力的化療輔助藥物。

參考文獻(xiàn)：

[2]Kamiya-Matsuoka C,Gilbert MR.Treating recurrent glioblastoma:an update[J].CNS Oncol,2015,4(2):91-104.

[3]Guo B,Zhang T,Su J,et al.Oxymatrine targets EGFR (p-Tyr845) and inhibits EGFR-related signaling pathways to suppress the proliferation and invasion of gastric cancer cells[J].Cancer Chemother Pharmacol,2015,75(2):353-363.

[4]陳曉峽,向小慶,葉紅.苦參堿及氧化苦參堿抗腫瘤作用的研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2013,19(11):361-364.

[5]馬玲娣,張彥,文世宏,等.苦參堿對(duì)TIM2轉(zhuǎn)基因小鼠肝癌細(xì)胞的作用研究[J].中國(guó)中藥雜志,2008,33(10):1175.

[6]Wang Z,Wu Y,Wang Y,et al.Matrine inhibits the invasive properties of human glioma cells by regulating epithelial to mesenchymal transition[J].Mol Med Rep,2015,11(5):3682-3686.

[7]Zhang S,Qi J,Sun L,et al.Matrine induces programmed cell death and regulates expression of relevant genes based on PCR array analysis in C6 glioma cells[J].Mol Biol Rep,2009,36(4):791-799.

[8]Takakura K,Shitara N,Kohno T.Adjuvant immunotherapy with levamisole for malignant glioma[J].No To Shinkei,1983,35(3):299-303.

[9]楊勁松,陸雪官.高分級(jí)腦膠質(zhì)瘤綜合治療循證醫(yī)學(xué)研究進(jìn)展[J].中華腫瘤防治雜志,2007,14(13):1025-1028.

[10]S?derberg-Nauclér C,Johnsen JI.Cytomegalovirus in human brain tumors:Role in pathogenesis and potential treatment options[J].World J Exp Med,2015,5(1):1-10.

[11]王銳,姜小軍,鄭婕,等.氧化苦參堿增強(qiáng)環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠LEWIS肺癌生長(zhǎng)的抑制作用[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2008,29(4):399-403.

[12]王馳,葉琳,沈娜,等.氧化苦參堿與常見腫瘤藥物相互作用對(duì)HNE-1、HNE-1(200)細(xì)胞周期的影響[J].腫瘤學(xué)雜志,2009,15(7):622-624.

[13]劉秀均,劉婷.苦參堿聯(lián)合順鉑抗肝癌[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2007,13(6):37.

[14]楊澤松,陳建斌,張紅賓,等.苦參堿葡萄糖注射液聯(lián)合CHOP方案治療非霍奇金淋巴瘤的臨床研究[J].中成藥,2007,29(12):1728-1730.

[15]邢曉靜,張麗紅,蔡玉文,等.苦參堿聯(lián)合化療治療進(jìn)展期胃癌療效分析[J].遼寧中醫(yī)雜志,2007,34(12):1742.

[16]Zhang S,Kan QC,Xu Y,et al.Inhibitory effect of matrine on blood-brain barrier disruption for the treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis[J].Mediators Inflamm,2013:736085.

作者單位：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院a.急診科，b.社會(huì)服務(wù)部，沈陽(yáng) 110004