靳　鑫，秦曉紅，許　莉，宿　冰，穆曉婷，劉豪華，李亞麗，?！槪瑥垨|方*

HPLC法同時(shí)測定雞眼草中染料木素和山柰酚的含量

靳鑫1，秦曉紅2，許莉3，宿冰1，穆曉婷1，劉豪華1，李亞麗1，祝崢1，張東方1*

[摘要]目的建立HPLC同時(shí)測定雞眼草藥材中染料木素和山柰酚含量的方法。方法采用RP-HPLC法。色譜柱為Diamons C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-體積分?jǐn)?shù)0.1%磷酸水溶液(體積比為72∶28)，流速為1.0 mL/min，檢測波長為370 nm，柱溫為30 ℃。結(jié)果染料木素和山柰酚質(zhì)量濃度分別在0.50~4.02 mg/L和0.15~1.20 mg/L內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，平均回收率分別為99.7 %和100.9%，RSD分別為0.1%和0.7% (n=6)。結(jié)論建立的方法簡便，準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，可用于雞眼草藥材中染料木素和山柰酚的含量測定。

[關(guān)鍵詞]雞眼草；染料木素；山柰酚；高效液相色譜；含量測定

[Abstract]ObjectiveTo establish a method for the simultaneous quantitative analysis of genistein and kaempferol in the aerial parts of Kummerowia striata with HPLC.MethodsThe chromatographic column was Diamonsil C18(150 mm×4.6 mm，5 μm);the mobile phase was methnol and aqueous solution containing 0.1 % phosphoric acid with the volume ratio of 72∶28 and the flow rate was 1.0 mL/min;the UV detection wavelength was 370 nm;the oven temperature was 30 ℃.ResultsThe linear ranges of genistein and kaempferol were 0.50~4.02 mg/L and 0.15~1.20 mg/L,respectively.The average recoveries (n=6) of genistein and kaempferol were 99.7% with RSD of 0.1%,100.9% with RSD of 0.7%,respectively.ConclusionThe method is simple and accurate,it can be used to determine genistein and kaempferol in the aerial parts of Kummerowia striata.

收稿日期：2015-04-03

通信作者*

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201512022

Simultaneous determination of Genistein and Kaempferol fromKummerowiastriataby HPLCJIN Xin1,QIN Xiao-hong2,XU Li3,SU Bing1,MU Xiao-ting1,LIU Hao-hua1,LI Ya-li1,ZHU Zheng1,ZHANG Dong-fang1*(1.School of Pharmacy,China Medical University,Shenyang 110001,China;2.Department of Pharmacy,Jianping Hospital of Liaoning Province,Chaoyang 122400,China;3.Traditional Chinese Medicine Research Institute of Liaoning Province,Shenyang 110041,China)

Key words：Kummerowiastriata;Genistein;Kaempferol;HPLC;Content determination

0引言

雞眼草[Kummerowiastriata(Thunb) Schin-dl.]為豆科(Leguminosae)雞眼草屬植物，干燥全草入藥，味苦，性涼，歸胃、大腸經(jīng)，有清熱解毒、健脾利濕的功效，臨床主要用于治療胃腸炎、痢疾和泌尿系統(tǒng)感染，尤其對(duì)嬰幼兒腹瀉[1]和嬰幼兒輪狀病毒腸炎[2]有顯著療效，且服用安全。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，從雞眼草乙酸乙酯提取物中分離得到大量黃酮類化合物[3]，藥理實(shí)驗(yàn)顯示出較好的抗炎活性[4-5]，具有重要的開發(fā)價(jià)值。目前,對(duì)雞眼草中的總黃酮進(jìn)行含量測定多用紫外分光光度法[6]，但此法操作繁瑣，干擾因素眾多，實(shí)驗(yàn)精密度較差。為更好地控制雞眼草藥材及其產(chǎn)品的質(zhì)量，本文建立HPLC法同時(shí)對(duì)雞眼草中黃酮類成分染料木素和山柰酚的含量進(jìn)行測定。

1儀器與試藥

1.1儀器SHIMADZU UV-1700紫外-可見光檢測儀(日本Shimadzu公司)，Agilent 1260高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，SB4200DT超聲波清洗儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)，BS110S分析天平(德國Sartorius公司 0.01 mg)。

1.2試藥染料木素對(duì)照品(批號(hào)：111704-200501)、山柰酚對(duì)照品(批號(hào):110861-200808)購自于中國藥品生物制品檢定所。雞眼草購于河北安國藥材市場(產(chǎn)地：遼寧，批號(hào)：20131026)，經(jīng)中國醫(yī)科大學(xué)張東方教授鑒定為雞眼草Kummerowiastriata(Thunb) Schindl.地上部分。甲醇(色譜純，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司)，純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)，磷酸(分析純，沈陽經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)試劑廠)，其他試劑均為市售分析純?cè)噭?/p>

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件Diamonsil C18色譜柱(150 mm × 4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相：甲醇-體積分?jǐn)?shù)0.1%的磷酸水溶液(72∶28)，流速：1.0 mL/min，檢測波長：370 nm，柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：10 μL。見圖1。

圖1　對(duì)照品溶液(A)和供試品溶液(B)的HPLC圖

2.2溶液的制備

2.2.1混合對(duì)照品溶液精密稱取染料木素對(duì)照品5.02 mg和山柰酚對(duì)照品5.01 mg，分別置于100 mL容量瓶中，用色譜甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得染料木素和山柰酚對(duì)照品質(zhì)量濃度分別為50.2 mg/L和50.1 mg/L的對(duì)照儲(chǔ)備液。精密量取染料木素對(duì)照品儲(chǔ)備液1.0 mL和山柰酚對(duì)照品儲(chǔ)備液0.3 mL，置于同一100 mL容量瓶中，用色譜甲醇定容，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得混合對(duì)照品溶液。

2.2.2供試品溶液稱取干燥至恒重的雞眼草藥材約1.0 g，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加入色譜甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，浸泡30 min后，超聲提取30 min，取出放冷至室溫，再稱定質(zhì)量，用色譜甲醇補(bǔ)足損失的質(zhì)量，搖勻，濾過，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.3線性關(guān)系考察精密吸取混合對(duì)照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，用色譜甲醇稀釋，定容至刻度，搖勻。按“2.1”項(xiàng)色譜條件，注入液相色譜儀，記錄峰面積。以各對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度X(mg/L)為橫坐標(biāo)、色譜峰面積Y為縱坐標(biāo)，求得回歸方程，見表1。

2.4精密度試驗(yàn)精密吸取混合對(duì)照溶液10 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，連續(xù)測定色譜峰面積6次，計(jì)算染料木素和山柰酚峰面積的RSD分別為0.8%和1.1%，表明儀器精密度良好。

表1　2種化合物的回歸方程

2.5重復(fù)性試驗(yàn)取雞眼草藥材，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備供試溶液6份，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下分析，計(jì)算染料木素和山柰酚峰面積的RSD分別為1.0%和1.7%。表明方法重現(xiàn)性較好。

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試溶液，室溫放置，分別在0、2、4、6、8、10、12 h，按“2.1” 項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算染料木素和山柰酚峰面積的RSD分別為1.4%和0.9%，表明混合供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7回收率試驗(yàn)精密稱取干燥至恒重的雞眼草藥材各1.0 g，共6份。每份分別精密加入質(zhì)量濃度為50.2 mg/L的染料木素對(duì)照儲(chǔ)備液1.0 mL和質(zhì)量濃度為16.5 mg/L的山柰酚對(duì)照儲(chǔ)備液1.0 mL，混勻后干燥。按“2.2.2”項(xiàng)方法制備供試溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下分析，計(jì)算回收率。結(jié)果見表2。

表2　2種化合物回收率試驗(yàn)(n=6)

2.8樣品測定精密稱取干燥至恒重的雞眼草藥材3份，每份1.0 g，按“2.2.2”項(xiàng)方法制備，按“2.1”項(xiàng)方法進(jìn)樣，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算雞眼草藥材中染料木素和山柰酚的含量。結(jié)果見表3。

3討論

表3　雞眼草中染料木素和山柰酚的含量(n=3)

3.1檢測波長的考察取一定質(zhì)量濃度的染料木素和山柰酚甲醇溶液，在200~400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，染料木素在254 nm處有最大吸收，山柰酚在370 nm處有最大吸收?？紤]到山柰酚含量較低，且染料木素在370 nm處也有較強(qiáng)的吸收，最終確定370 nm為檢測波長。

3.2樣品提取方法的考察本實(shí)驗(yàn)考察了70 ℃甲醇回流提取1 h和甲醇超聲提取30 min兩種方法對(duì)染料木素和山柰酚效率的影響。結(jié)果表明，兩種提取方法的提取效率相當(dāng)，因超聲提取法操作簡便、快速，故最終選擇甲醇超聲提取的方法。比較15、30、45、60 min不同超聲時(shí)間對(duì)樣品提取效率的影響。結(jié)果表明，超聲30 min 可將染料木素和山柰酚甲醇提取完全，因此最終確定超聲提取時(shí)間為30 min。

3.3流動(dòng)相的考察染料木素和山柰酚均具有酚羥基，顯弱酸性，在水中易發(fā)生電離，產(chǎn)生拖尾現(xiàn)象。為了改善拖尾峰形和提高分離度，可降低流動(dòng)相的pH值，以抑制酚羥基電離[7]。筆者比較了流動(dòng)相中加入不同濃度冰醋酸、甲酸和磷酸對(duì)樣品分離的影響。結(jié)果表明，加入體積分?jǐn)?shù)0.1%磷酸溶液作為酸化試劑時(shí)，可使峰形明顯改善。

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作者單位：中國醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院a.中心實(shí)驗(yàn)室，b.藥物化學(xué)教研室，沈陽 110122