齊雅琳， 王金平， 李 正， 韓素貞　(首都師范大學生命科學學院，北京 100048)

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陜西等地區(qū)豆科植物根瘤內生細菌遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育研究

齊雅琳， 王金平， 李 正， 韓素貞*(首都師范大學生命科學學院，北京 100048)

根瘤菌是一類廣泛分布于土壤中的革蘭氏陰性細菌，其顯著特點是能夠通過侵染豆科植物的根或莖形成根瘤或莖瘤與豆科植物進行共生固氮[1]，屬于根瘤內生細菌，它可將空氣中游離態(tài)的氮氣轉化為化合態(tài)氮，以氨的形式為宿主植物提供氮素營養(yǎng)。然而，在豆科植物的根瘤內，不但有根瘤菌能與之形成共生關系；還存在許多非共生細菌，能與之形成多種相互關系。相對根瘤菌而言，對根瘤內生細菌的研究相對較少。

植物內生細菌是指能定殖在活體植物內，一般不引起寄(宿)主植物組織結構發(fā)生明顯變化和病害癥狀，且能夠與植物建立動態(tài)平衡和諧聯(lián)合關系的一類微生物[2]。植物內生細菌具有豐富的多樣性，部分植物內生細菌具有生物防治、植物促生和內共生固氮等作用[3-4]。由于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中大量使用農(nóng)藥和化肥，使得植物和土壤中微生物的多樣性大為減少；重視植物內生細菌的研究與應用，可有效減少和替代農(nóng)藥以及化肥的使用。研究以及保護植物內生細菌的多樣性對于保持微生物多樣性及改善農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)具有重要意義[5]。

陜西省神木縣、甘肅省天水市以及青海省澤庫縣位于我國西北部地區(qū)，具有地勢較高，冬長夏短，年降雨量較少，日照時間長，溫差較大，土壤資源種類豐富等特點。由于此前對該地域豆科植物根瘤內生細菌資源多樣性研究較少，故筆者對從該地域采集的豆科植物根瘤內生細菌的多樣性和系統(tǒng)發(fā)育進行研究，對于豐富我國根瘤內生細菌資源具有重要意義。

1材料與方法

1.1材料將采集自陜西神木等地區(qū)的根瘤用無菌水浸泡過夜，95%乙醇浸泡5 min后用0.1% HgCl2表面滅菌5 min，無菌水洗滌 6次，然后用無菌鑷子將其夾碎，擠出汁液，逐個劃線接種于YMA 平板[6]，于 28 ℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)3～7 d。挑取單菌落劃線純化，進行革蘭氏染色并鏡檢[7]，將革蘭氏陰性(G-)桿菌作為供試菌并用甘油保存法將其保存于-80 ℃冰箱。選用供試菌株50株，參比菌株8株，詳情見表1。

1.2方法

參考文獻1.2.116S rDNA PCR-RFLP DNA提取。提取方法見[8]。正向引物P1為5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3′，其序列對應于E.coli 16S rDNA基因第8～37堿基位置；反向引物P6 為 5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC -3′，其序列為對應第1 479～1 506 堿基位置[9]，引物由上海生工生物公司合成。

擴增體系(50 μl)：2×TaqPCR Green Mix (0.1 U/μlTaqDNA聚合酶，2×反應緩沖液，3 mmol/L MgCl2，0.4 mmol/L dNTPs )25 μl，DNA模板10 μl,引物P1 1 μl,引物P6 1 μl,ddH2O補充至50 μl。

PCR的反應條件：92 ℃預變性 5 min；94 ℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸 2 min，32 個循環(huán)；72 ℃延伸 6 min；4 ℃貯存。擴增產(chǎn)物用1%含EB的瓊脂糖凝膠檢測，100 V電泳15 min，UV掃描，并保存為TIF文件。

用4 種限制性內切酶：HinfⅠ、MspⅠ、AluⅠ和HaeⅢ對擴增產(chǎn)物進行酶切。

酶切反應體系(30 μl)：PCR產(chǎn)物10 μl，內切酶緩沖液2 μl，內切酶(約10U)1 μl，ddH2O補充至30 μl。

按反應體系配制，37 ℃水浴4 h。取15 μl酶切產(chǎn)物與3 μl 6×Loading Buffer混合后點樣，用3%含EB的瓊脂糖凝膠，100 V水平電泳1.5 h，UV掃描，并保存為TIF格式文件。

對4種酶切圖譜作均一化處理，把所得的酶切帶型轉化為“0”和“1”數(shù)字符，即有條帶記為“1”，無條帶記為“0”，以平均連鎖法(UPGMA)聚類，通過NTSYS.2.10軟件進行相似性分析，最后繪制成UPGMA樹狀圖[10]。

表1　供試菌株及參比菌株

注：T：type strain。IAM.Institute of Applied Microbiology，The University of Tokyo，Tokyo，Japan; LMG.Collection of Bacteria of the Laboratorium voor Microbiologie，University of Ghent，Ghent，Belgium; USDA.United States Department of Agriculture; NZP.Culture Collection of the Department for Scientific and Industrial Research，Biochemistry Division， Palmerston North，New Zealand; CFN.Centro de Investigacion sobre Fijacion de Nitrogeno，UNAM.Cuernevaca，Mexico.

1.2.216S rDNA全序列分析。根據(jù)16S rDNA PCR-RFLP的酶切樹狀圖結果，選取每個表觀群代表菌株進行16S rDNA PCR擴增[11]，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后交由上海生工生物公司進行測序，將測得序列與GenBank中已知種序列通過MEGA5.0 中的ClustalW 進行多序列比對，系統(tǒng)發(fā)育樹的構建采用鄰接法(Neighbour-joining)[12]，相似性計算采用Kimura two-parameter模型[13]，自展值(Bootstrap)為1 000[14-15]，并計算各菌株之間的相似性距離。

1.2.3BOX -PCR 指紋圖譜分析。DNA 提取同“1.2.1”。引物為 BOXA1R ：5′-CTA CGG CAA GGC GACGCT GAC G -3′[16]，擴增過程見參考文獻[17]。BOX-PCR產(chǎn)物經(jīng) 1.5% 瓊脂糖凝膠(含 EB)電泳分離，電泳條件為100 V，1.5 h，UV掃描，將圖譜保存為TIF格式文件，之后對BOX -PCR 指紋的電泳圖像進行觀察比較和分析。

2結果與分析

2.116S rDNA PCR-RFLP分析通過50株供試菌株和8株已知參比菌株16S rDNA PCR-RFLP結果分析，建立了聚類樹狀圖(圖1)。由圖1可知，在81.5%的水平上，供試菌株聚成了4個分支；在86%的相似性水平上，分支I又分為群1、群2和群3，分支III又分為群4、群5以及群6。群1包括CNU 093801與BradyrhizobiumjaponicumUSDA 6T所形成的分支，群2包括CNU 091209等6株供試菌株與SinorhizobiumfrediiUSDA 205T、S.americanumCFN156T、S.melilotiUSDA 1002T、MesorhizobiumlotiNZP 2213T、RhizobiumleguminosarumUSDA2370T所形成的分支，這6株供試菌株宿主均為Glycinemax。

群3由參比菌株AgrobacteriumtumefaciensIAM13129T、A.rubiLMG 156T和與其聚在一起的CNU 091238組成，供試菌株宿主為Vignaangularis。除分支I與參比菌株聚在一起外，分支II、III、IV均未與參比菌株聚在一起。分支II涵蓋來自甘肅天水、青海澤庫、陜西神木3個采集地區(qū)的27株供試菌株，宿主很廣泛，有Kummerowiastriata、Oxytropisochrocephala、Glycinemax、Phaseolusvulgaris4種豆科植物。與此類似，未能與參比菌株聚在一起的分支III分為3個群，群4由CNU 093803在內的6株菌構成，宿主同樣來自3個地區(qū)，涵蓋4種豆科植物；群5由CNU 091208和CNU 091246組成；群6由CNU 091221在內的5株菌構成，且群5和群6的宿主均為采集自陜西神木的Glycinemax。分支Ⅳ則由2株供試菌株CNU 091213和CNU 091250形成的獨立分支組成。這2株菌宿主都是Glycinemax，采集地都在陜西神木。

2.216S rDNA 全序列分析依據(jù) 16S rDNA PCR-RFLP 聚類結果，選取各分支代表菌株 1～3 株共20株進行 16S rDNA 全序列測定，并根據(jù)測序結果構建系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖(圖2)。由圖2可知，16S rDNA 測序結果與 16S rDNA PCR-RFLP 的結果基本一致。

由圖2可知，處于分支I群2的5株中華根瘤菌CNU 091209、CNU 091211、CNU 091214、CNU 091223、CNU 091239的系統(tǒng)發(fā)育相似性為100%，需要進一步通過BOX-PCR指紋圖譜來判斷是否為同一個克隆。處于分支I群3的CNU 091238與A.tumefaciensIAM 13129T的相似性為99.5%；處于分支I群1的CNU 093801與B.japonicumLMG 6138T的相似性為99.4%，這2株菌需要通過與參比菌株進行DNA-DNA同源性分析確定是否為新種。

處于分支II的CNU 091249在內的屬于芽孢桿菌屬的6株菌，與以CNU 091213和CNU 091250組成的分支IV且屬于類芽孢桿菌屬的2株菌聚在一起，其中CNU 091222與CNU 091224的相似性為100%，需要進一步通過BOX-PCR指紋圖譜來判斷是否為同一個克隆。在芽孢桿菌屬和類芽孢桿菌屬的系統(tǒng)發(fā)育分支構建上，16SrDNA全序列測定結果較16S rDNA PCR-RFLP 聚類結果更為準確合理。

此外，圖2還顯示出根瘤內生細菌的多樣性。其中CNU 091208與寡養(yǎng)單胞菌屬StenotrophominasrhizophilaDSM 14405T的相似性為100%；CNU 091235與假單胞菌屬PseudomonaskoreensisLMG 21318T的相似性為99.8%；而CNU 093803與CNU 091233、CNU 091243的相似性均為99.8%，且這3株菌與泛菌屬PantoeaagglomeransATCC 27155T的相似性均在99.8%以上。

2.3BOX-PCR結果由于分支I群2內屬于中華根瘤菌屬的菌株CNU 091209、CNU 091211、CNU 091214、CNU 091223和CNU 091239的16S rDNA序列相似性達到100%，分支II屬于芽孢桿菌屬的菌株 CNU 091222和CNU 091224的相似性也達到 100%(圖2)。故對這些菌株分別進行了 BOX-PCR(圖3)。從圖3可以看出，CNU 091211、CNU 091223與CNU 091239的BOX指紋圖譜一致，代表這3株菌為同一個克??；而CNU 091209、CNU 091214與這3株菌的BOX指紋圖譜不一致，則與這3株不是相同克隆。此外，指紋圖譜不一致的3株菌需要通過與參比菌株進行DNA-DNA同源性分析以確定是否為新種。分支II中屬于芽孢菌屬的CNU 091222與CNU 091224的 BOX 指紋圖譜一致，所以這2株菌也為同一個克隆。

3討論

3.1陜西等地區(qū)根瘤內生根瘤菌的多樣性從50株供試菌株中，有6株分離自陜西神木大豆根瘤內的內生細菌屬于中華根瘤菌屬，無論是16S rDNA PCR-RFLP還是16S rDNA全序列分析，它們都與S.fredii和S.americanum聚在一起。S.fredii是Scholla 等[18]于1984年發(fā)現(xiàn)并命名為Rhizobiumfredii；Chen等[19]在1988年從中國新疆大豆中也分離到該菌，基于研究結果，她提出建立新屬Sinorhzobium并將其歸并其中，將該菌重新命名為S.fredii。該種的宿主主要是大豆，并在大豆根瘤中占有優(yōu)勢，該研究結果與此有較好的一致性。此外，在豇豆、金合歡、菜豆、扁豆等宿主根瘤內分離到該種根瘤菌[20-23]。S.americanum則分離自墨西哥的金合歡屬植物Acaciaacatlensis，該菌株與S.fredii在16S rDNA水平上相似性較高，能通過DNA雜交、nifH和部分生理生化特征來區(qū)分這2株菌[24]。1株分離自甘肅天水雞眼草根瘤內的內生細菌屬于慢生根瘤菌屬。B.japonicum是從日本大豆中分離出來的慢生根瘤菌，隨著研究的深入，學者們發(fā)現(xiàn)其宿主植物眾多，從花生、豇豆、綠豆、雞眼草、葛藤、金合歡、杭子梢等多種豆科植物中均可分離到[25-26]。

3.2陜西等地區(qū)根瘤內非共生菌從50株供試菌株中，分離到1株屬于土壤桿菌屬的菌。近年來，從豆科植物根瘤內分離到土壤桿菌的報道愈發(fā)頻繁。1997年Tan等[27]從采集自陜西等地的甘草、狼牙刺、錦雞兒等植物的根瘤中分離到A.tumerfaciens；1999年de Lajudie等[28]從非洲合歡等植物根瘤中分離到了A.tumerfaciens；2005年Liu等[29]從紫藤根瘤中也分離到了土壤桿菌。此外，Kan等[30]、Liu等[31]、Li等[32]相繼從不同豆科植物中分離到土壤桿菌。該研究分離到的A.tumerfaciens的宿主是采集自陜西神木的赤豆，此前尚未有分離自赤豆根瘤中土壤桿菌的報道。根瘤內生土壤桿菌影響宿主植物結瘤與生長的方式主要體現(xiàn)在對結瘤數(shù)量、重量、效率、固氮能力、形態(tài)發(fā)育的影響以及對其侵入根瘤的途徑等方面[33-35]。目前，土壤桿菌對豆科植物根瘤的侵染過程及其與根瘤菌、宿主植物之間的互作是一個極其復雜的過程，尚未有研究準確揭示其機制[36]。

從50株供試菌株中，分離到了27株菌屬于芽孢桿菌屬，宿主囊括大豆、菜豆、雞眼草和黃花棘豆；2株屬于類芽孢桿菌屬，宿主均為大豆。2株屬于寡養(yǎng)單胞菌屬，5株屬于假單胞菌屬，宿主均為大豆。6株屬于泛菌屬，宿主囊括大豆、菜豆、雞眼草和黃花棘豆。從根瘤中分離到芽孢桿菌的現(xiàn)象時有報道，且芽孢菌作為植物內生細菌，在某些情況下對植物的生長有一定程度的幫助[31-32]。2002年，Bai等[37]發(fā)現(xiàn)部分Bacillus屬的菌株在與B.japonicum共同接種大豆時，能夠增加大豆重量。2005年，Arkhipova等[3]指出，Bacillussubtilis接種植物時能產(chǎn)生細胞分裂素，還能影響植物內源激素的增加。2008年，Zhang等[38]從采集自河北的大豆根系中分離到一株芽孢桿菌新種并命名為Bacillusendoradicis。

2008年，Li等[32]發(fā)現(xiàn)我國東北地區(qū)栽培大豆的根瘤中不僅能分離到慢生根瘤菌、芽孢菌、土壤桿菌，還能分離到泛菌屬的細菌，該報道指出成團泛菌(Pantoeaagglomerans)是一種普遍存在于根瘤內的內生菌，且在采集地黑龍江地區(qū)的大豆根瘤中占有主要地位；其能夠產(chǎn)生IAA從而促進植物生長，還具有一定的固氮能力。2003年研究表明在地瓜莖中分離到的Pantoeaagglomerans同樣具有固氮能力[39]。

2005年，Di Simona等[40]從富含硒的紫云英屬植物(Astragalusbisulcatus)的根際土壤中分離到寡養(yǎng)單胞菌。2007年，Kan等[30]從青海省的Viciaangustifolia(窄葉野豌豆)中分離到2株菌屬于寡養(yǎng)單胞菌屬。

類芽孢桿菌屬是一類普遍存在于自然中并在根際、葉圈、植物內生組織中廣泛存在的植物內生細菌[41]。2006年，Zakhia等[42]從突尼斯的野生豆科植物根瘤中分離到屬于類芽孢桿菌屬(宿主為Lotusargenteus)和假單胞菌屬的內生菌(宿主為Medicagotruncatula和Hedysarumcarnosum)。Valverde等[43-44]相繼在2008年和2010年分別從歐洲栗(Cataneasativa)葉圈和木豆樹屬植物(Prosopisfarcta)根瘤中分離到2株類芽孢桿菌新種Paenibacilluscastaneae和Paenibacillusprosopidis。2009年，Son等[45]通過試驗驗證了Paenibacilluspolymyxa和Paenibacilluslentimorbus能夠在一定程度上有效抑制由根結線蟲(Meloidogyneincognita)和尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporumf.sp.lycopersici)引起的植物病害。2013年Carro等[41]從鷹嘴豆(Cicerarietinum)中分離到一株類芽孢桿菌新種并命名為Paenibacillusendophyticus。同年Zhang等[46]從梓屬植物Catalpaspeciosa的根際土壤中分離到一株類芽孢桿菌新種并命名為Paenibacilluscatalpae。2014年，Carro等[47]又從采集自西班牙的白羽扇豆(Lupinusalbus)的根瘤中分離出一株類芽孢桿菌屬新種并命名為Paenibacilluslupin。

4結論

綜上所述，利用多相分類方法對陜西等地區(qū)豆科植物根瘤內生菌資源進行調查，顯示了陜西等地豆科植物根瘤內生菌具有豐富的遺傳多樣性。有學者指出，由于受到豆科植物所處區(qū)域、氣候環(huán)境、土壤條件、人類活動影響以及在分離根瘤內生菌時的試驗條件、所用培養(yǎng)基、培養(yǎng)方法等的影響，故從豆科植物根瘤中分離到的內生菌會有差異性。

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摘要采用 16S rDNA PCR-RFLP、16S rDNA全序列分析、BOX-PCR等多相分類技術，對采集自陜西神木、甘肅天水、青海澤庫地區(qū)的豆科植物根瘤內生細菌資源的多樣性進行了研究。從采集的豆科植物根瘤中共分離到50株供試菌株，對這50株供試菌株和8株參比菌株進行了16S rDNA PCR-RFLP 聚類分析。結果顯示，全部供試菌株在81.5%的相似性水平上分成4個分支(在86%相似性水平上，分支I包括3個群，分支III包括3個群)。選取各群代表菌株進行16S rDNA 測序，確定了50株供試菌株中，1株屬于慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)，1株屬于土壤桿菌屬(Agrobacterium)，6株屬于中華根瘤菌屬(Sinorhizobium)，27株屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)，2株屬于類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)，其余13株則分別歸屬于寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和泛菌屬(Pantoea)。表明16S rDNA PCR-RFLP和16S rDNA全序列分析結果具有較好的一致性。對部分16SrDNA序列相似性達到100%的菌株進行BOX-PCR來確定是否為同一克隆。研究結果表明，陜西神木等地區(qū)豆科植物根瘤內生菌具有很豐富的遺傳多樣性。

關鍵詞根瘤內生菌；根瘤菌系統(tǒng)發(fā)育；多樣性

Studies on the Diversity and Phylogeny of Endophytes Isolated from Root Nodules of Legumes in Shaanxi and Other Regions

QI Ya-lin, WANG Jin-ping, LI Zheng, HAN Su-zhen*(College of Life Science, Capital Normal University, Beijing 100048)

AbstractThe diversity and phylogeny of endophytic bacteria isolated from root nodules of Legumes in Shaanxi and other regions were investigated by several kinds of polyphasic taxonomy technology. 50 strains isolated from root nodules of Kummerowia striata, Oxytropis ochrocephala, Glycine max, Phaseolus vulgaris with other 8 reference strains were first cluster analyzed by 16S rDNA PCR-RFLP. Results indicated that all isolates included 8 reference strains were clustered into 4 branches at 81.5% similarity. Branch I included 3 groups and branch III included 3 groups at 86% similarity. Representative strains were selected in the analysis of 16S rDNA sequencing, Bacillus was the most frequently isolated endophytic bacteria genera which involved 27 strains. Pantoea, Pseudomonas and Sinorhizobium occurred less frequently with a range of 5-6 strains. Well Stenotrophomonas, Paenibacillus, Bradyrhizobium and Agrobacterium shared a relatively low frequently of 1-2 strains. The results showed that 16S rDNA PCR- RFLP and16S rDNA sequencing analysis were in good agreement. BOX-PCR summarization above appeared that endophytes isolated from root nodules of Legumes in Shaanxi and other regions had high genetic diversity.

Key wordsNodule endophytes Rhizobia; Phylogeny; Diversity

收稿日期2015-04-27

通訊作者

作者簡介齊雅琳(1989- )，女，北京人，碩士研究生，研究方向：細菌分類學。*，副教授，碩士生導師，博士，從事微生物分類研究。

中圖分類號S 432.4+2

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2015)18-056-06