索化夷，趙 欣，騫 宇，陳 娟，李 鍵，張 玉，王遠微，闞建全,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400715；3.重慶第二師范學(xué)院生物與化學(xué)工程系，重慶 400067；4.西南民族大學(xué)青藏高原研究院，四川 成都 610041）

永川豆豉發(fā)酵過程中總糖和氨基酸變化與滋味的形成

索化夷1,2，趙 欣3，騫 宇3，陳 娟4，李 鍵4，張 玉1,2，王遠微1，闞建全1,2,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400715；3.重慶第二師范學(xué)院生物與化學(xué)工程系，重慶 400067；4.西南民族大學(xué)青藏高原研究院，四川 成都 610041）

通過采集傳統(tǒng)發(fā)酵過程中的永川豆豉樣本，對其總糖、還原糖、糖化酶活性、總氨基酸、游離氨基酸構(gòu)成進行測定。結(jié)果表明，在成品豆豉游離氨基酸中，鮮味氨基酸占總游離氨基酸的23.98%，鮮味風(fēng)味突出。豆豉中甜味氨基酸和還原糖共同構(gòu)成了其回甜的滋味特點。豆豉中短鏈脂肪酸和乳酸使其呈現(xiàn)一定的酸味，酚類物質(zhì)和苦味氨基酸呈現(xiàn)一定的苦味。這些最終決定了永川毛霉型豆豉的特有的咸鮮回甘風(fēng)味特點。

永川豆豉；總糖；氨基酸；滋味形成

豆豉是我國西南地區(qū)的一種集營養(yǎng)與風(fēng)味為一體的傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品，頗受人民群眾的喜愛。豆豉中含有大豆多肽、大豆皂苷、大豆低聚糖、大豆異黃酮、褐色色素和溶栓酶等功能性物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)豆豉具有抗氧化[1-2]、降壓[3-5]、降血糖[6]等多種保健功能。

大豆經(jīng)過發(fā)酵后往往會具有更優(yōu)良的口感、質(zhì)地和風(fēng)味，從而受到廣大消費者的喜愛[7-9]。這種質(zhì)地和風(fēng)味的改變與其基本成分的改變有著密切的關(guān)系[10]。蛋白質(zhì)、脂肪、淀粉結(jié)構(gòu)的降解會引起食品質(zhì)構(gòu)發(fā)生改變，使食品口感更加細膩綿軟。另外，蛋白質(zhì)降解成多肽和氨基酸，不但提高了食品的營養(yǎng)價值[10-12]，而且多肽和游離氨基酸的構(gòu)成還決定了發(fā)酵食品的滋味[9,13-16]。永川豆豉作為四大豆豉品系之一的毛霉型豆豉，以色澤晶瑩、光滑黝黑、清香散粒、入口化渣回甜、豉香濃郁等特點著稱。但其目前存在生產(chǎn)過程缺少科學(xué)的控制標(biāo)準(zhǔn)、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定等問題。對于永川毛霉型豆豉總糖和氨基酸成分在發(fā)酵過程的變化規(guī)律和特點的研究有利于分析其滋味形成機理。目前，永川毛霉型豆豉滋味形成機理還未見報道。

本研究對永川毛霉型豆豉傳統(tǒng)發(fā)酵過程中總糖、還原糖、糖化酶活性、總氨基酸、游離氨基酸構(gòu)成進行測定，研究評價豆豉基本成分的變化規(guī)律，以期為永川毛霉型豆豉的生產(chǎn)工藝優(yōu)化、產(chǎn)品質(zhì)量控制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

原料大豆產(chǎn)地吉林省。

1.2 試劑

葡萄糖、酚酞、硫酸、氫氧化鈉、3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）、硫酸鉀、鹽酸、無水乙醚、甲醛、硼酸均為分析純 成都市科龍化工試劑廠。

1.3 儀器與設(shè)備

JH-722分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；eLIX10 Millipore超純水系統(tǒng) 美國密理博公司；H-2050R臺式高速冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；L-8800全自動氨基酸分析儀 日本日立公司。

1.4 方法

1.4.1 永川毛霉型豆豉的制備

工藝流程：大豆篩選→浸泡→瀝干→常壓蒸料→冷卻→自然發(fā)酵制曲→翻曲→拌和（食鹽含量13～14 g/100 g、白酒、醪糟）→入罐發(fā)酵后熟→成品。

樣本采集后，檢測酶活的樣品立即檢測，其余樣品封入自封袋－20 ℃凍存，S1～S16分別代表了不同發(fā)酵時期的永川豆豉樣品。詳見表1。

表1 實驗樣品的編號Table 1 Numbering of different experimental samples

1.4.2 永川毛霉型豆豉總糖和還原糖含量的測定[17-18]

1.4.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 mg/mL），分別置入25 mL比色管中，并補水至2 mL，加1.5 mL DNS溶液，搖勻后于沸水浴中加熱5 min，取出，冷卻至室溫，用水稀釋至25 mL，于540 nm波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖的含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=0.612X+0.010 3，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 1。

1.4.2.2 樣品中還原糖的浸提

稱取5 g冷凍樣品于研缽中研磨均勻，從中取約3 g，放入100 mL的三角瓶中，先以少量蒸餾水?dāng)嚢璩珊隣?，然后加入蒸餾水50 mL，攪拌均勻，于50 ℃水浴20 min，浸提。濾紙過濾，用蒸餾水清洗濾渣，收集濾液，用蒸餾水定容至100 mL，即為樣品還原糖待測液。

1.4.2.3 樣品中總糖的水解和提取

稱取5 g冷凍樣品研缽研磨均勻，從中取約1 g，于100 mL的三角瓶中，加入10 mL 6 mol/L的鹽酸及15 mL蒸餾水，置于沸水浴中水浴30 min。取出，待三角瓶中水解液冷卻后加入一滴酚酞指示劑，以 6 mol/L NaOH中和至微紅色，過濾，用蒸餾水清洗殘渣，后將濾液定容至100 mL，待用。

1.4.2.4 還原糖含量及總糖含量測定

取樣品溶液1 mL置于25 mL比色管中，補水至2 mL，加1.5 mL DNS溶液，搖勻后于沸水浴加熱5 min，取出，冷卻至室溫，用水稀釋至25 mL，波長540 nm，試劑空白，測定吸光度，根據(jù)下式算出樣品的糖含量。

式中：C為查標(biāo)準(zhǔn)曲線所得水解后還原糖含量/mg；V1為提取液總體積/mL；V2為測定時取用液體積/mL；m為樣品質(zhì)量/mg。

1.4.3 永川毛霉型豆豉中糖化酶活性的測定

參照GB 8276—2006《食品添加劑 糖化酶制劑》[19]的方法測定。

1.4.4 永川毛霉型豆豉總氨基酸和游離氨基酸測定

采用氨基酸自動分析儀法[20]測定。

1.4.4.1 樣品總氨基酸測定前處理

準(zhǔn)確稱取樣品200 mg于試管中，向試管中加入14 mL 6 mol/L鹽酸，振蕩混勻。用酒精噴燈把試管口下端1/3處拉細到4～6 mm，抽真空10 min后封管。處理過的試管置（110±1） ℃恒溫烘箱中沙浴水解22 h，取出冷卻至室溫，搖勻過濾，取1 mL濾液于50 mL燒杯中，用60 ℃恒溫水浴蒸干濾液，用0.02 mol/L鹽酸稀釋4.5 倍，用0.45 μm濾膜過濾后上機測定。

1.4.4.2 樣品游離氨基酸測定前處理

準(zhǔn)確取樣品500 mg，于10 mL塑料離心管中，加入2 mL 4 g/100 mL磺基水楊酸溶液振蕩搖勻。將離心管于16 000 r/min離心5 min。稀釋后用0.45 μm濾膜過濾后上機分析。

1.4.4.3 分析條件

洗脫液經(jīng)泵1流過，泵壓10.622 kPa，流速0.45 mL/min；茚三酮經(jīng)泵2流過，泵壓0.980 kPa，流速0.35 mL/min。分離柱柱溫70 ℃；反應(yīng)柱柱溫135 ℃。

1.5 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 永川毛霉型豆豉在發(fā)酵過程中總糖和還原糖含量變化規(guī)律

圖1 豆豉發(fā)酵過程中總糖含量的變化Fig.1 Change in total sugar content in Douchi at different fermentation stages

圖2 豆豉發(fā)酵過程中還原糖含量的變化Fig.2 Change in reducing sugar content in Douchi at different fermentation stages

由圖1可知，大豆樣品的總糖含量經(jīng)浸泡和蒸煮后含量下降。主要有兩方面原因，一方面是損失一部分，另一方面是水分含量增加，總糖含量由27%下降到16%。在以后的制曲及后發(fā)酵過程中，由于其水解的單糖被微生物利用，總糖含量一直保持下降的趨勢。由于在拌料（S10）時加入醪糟，總糖含量提高到11.6%，同時繼續(xù)保持下降趨向，最終成品的含量只有1.35%。由圖1、2可知，在制曲過程中由于糖化酶活性高，還原糖的生成量略高于消耗量，所以還原糖含量在制曲階段緩慢上升。還原糖在拌料（S10）后明顯增加，這主要是由于拌料加入了醪糟等配料含有大量還原糖導(dǎo)致提高顯著，隨著后發(fā)酵進行，還原糖被微生物利用而逐漸下降[21]。

2.2 永川毛霉型豆豉在發(fā)酵過程中糖化酶活性變化規(guī)律

糖化酶又稱葡萄糖淀粉酶，它可以作用于淀粉非還原性末端，水解α-1,4葡萄糖苷鍵產(chǎn)生葡萄糖，同時也能緩慢水解α-1,6葡萄糖苷鍵轉(zhuǎn)化成葡萄糖。所以糖化酶的活性直接關(guān)系到淀粉分解成葡萄糖的程度[22]。由圖3可知，糖化酶在制曲過程中活性逐漸增加并在制曲后期達到最大值76.17 U/g，在后發(fā)酵階段由于拌料食鹽的添加，微生物活動受到抑制，糖化酶活性逐漸降低，最后在35 U/g左右保持穩(wěn)定。永川毛霉型豆豉糖化酶活性較高，使淀粉水解充分，有利于后發(fā)酵過程中微生物對葡萄糖的利用和轉(zhuǎn)化。

圖3 豆豉發(fā)酵過程中糖化酶活性的變化Fig.3 Change in cellulase activity in Douchi at different fermentation stages

2.3 永川毛霉型豆豉發(fā)酵過程中總氨基酸變化規(guī)律

表2 豆豉發(fā)酵過程中總氨基酸含量的變化Table 2 Change in total amino acid content in Douchi at different fermentation stages g/100 g

由表2可知，黃豆經(jīng)浸泡后由于水分含量增加，總氨基酸含量由23.358 g/100 g下降到15.385 g/100 g，隨著制曲過程水分的蒸發(fā)，總氨基酸含量逐漸增加到22.310 g/100 g。當(dāng)拌料后，由于拌入醪糟、食鹽、白酒總氨基酸含量下降到14.753 g/100 g，后發(fā)酵過程變化不大。成品豆豉中含有成人必需的除色氨酸外的7 種必需氨基酸：賴氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸。其中含量最高的前5 種氨基酸為谷氨酸（2.850 g/100 g）、天冬氨酸（1.669 g/100 g）、亮氨酸（1.351 g/100 g），半胱氨酸（0.944 g/100 g）和纈氨酸（0.877 g/100 g）。它們占豆豉總氨基酸的51.26%。成品豆豉的主要氨基酸構(gòu)成與大豆主要氨基酸構(gòu)成相似。

2.4 永川毛霉型豆豉發(fā)酵過程中游離氨基酸含量的變化

表3 豆豉發(fā)酵過程中游離氨基酸含量的變化Table 3 Change in free amino acid content in Douchi at different fermentation stages mg/g

由表3可知，游離氨基酸在豆豉發(fā)酵過程中發(fā)生了顯著的變化，游離氨基酸與豆豉風(fēng)味形成密切相關(guān)。游離氨基酸由原料黃豆的1.268 mg/g增加到成品豆豉的44.212 mg/g，增加了33.9 倍。成品豆豉的游離氨基酸按含量遞減順序確定的前5 個主要特征氨基酸譜為Glu+ Leu+Cys+Phe+Val。

3 討 論

豆豉中蛋白質(zhì)水解成短肽與豆豉滋味形成有一定關(guān)系，大量研究已表明，蛋白質(zhì)水解常引起苦味的產(chǎn)生，這是因為蛋白水解自然形成強烈疏水的肽和氨基酸等降解產(chǎn)物[23]，同時也會形成鮮味肽和甜味肽而弱化苦味。不同口味的多肽與鮮味、苦味、甜味氨基酸配合實現(xiàn)了永川毛霉型豆豉獨特的滋味。

在永川毛霉型豆豉發(fā)酵過程中，游離氨基酸由原料黃豆的1.268 mg/g增加到成品豆豉的44.212 mg/g，增加了33.9 倍，其游離氨基酸占總氨基酸29.5%。根據(jù)Tseng[24]、呂雪娟[25]、武彥文[26]等對滋味特征的描述，將氨基酸分為鮮味（Asp、Glu）、甜味（Ala、Gly、Ser、Thr）、苦味（Arg、His、Ile、Trp、Tyr、Val、Leu、 Met、Phe）和無味（Cys、Lys、Pro）4 種。游離呈味氨基酸的構(gòu)成在發(fā)酵食品的滋味形成中發(fā)揮了重要作用。根據(jù)游離氨基酸的構(gòu)成，將前5 種含量最高的呈味氨基酸依次排列就構(gòu)成風(fēng)味特征譜帶。秦禮康[27]在陳窖豆豉粑的研究中發(fā)現(xiàn)其譜帶為Arg、Glu、Phe、Leu、Lys。Fan Junfeng等[28]在對細菌型豆豉的研究中發(fā)現(xiàn)其譜帶為Glu、Leu、Phe、Val、Pro。Li Hua等[29]在對腐乳研究中發(fā)現(xiàn)腐乳呈味氨基酸譜帶為Glu、Pro、Asp、Leu、Alu。永川毛霉型豆豉的游離氨基酸按含量遞減順序確定的前5 個主要特征氨基酸譜為Glu、Leu、Cys、Phe、Val。這5 種氨基酸占總游離氨基酸的52.11%?？梢园l(fā)現(xiàn)不同大豆發(fā)酵食品中氨基酸構(gòu)成不一致，這與發(fā)酵菌群不同有關(guān)。其中Glu、Leu是大豆發(fā)酵食品中主要游離氨基酸。

在成品豆豉游離氨基酸中，鮮味氨基酸、甜味氨基酸、苦味氨基酸分別占總游離氨基酸的23.98%、12.88%和43.99%?？辔队坞x氨基酸占總游離氨基酸的43.99%，但在人們?nèi)粘５南M中并沒有感到永川豆豉有明顯的苦味。其表現(xiàn)的主要風(fēng)味是咸味和鮮味，略帶酸味、苦味或澀味，這與豆豉中高食鹽含量有關(guān)。永川豆豉中食鹽含量在13%～15%，遠遠高于其感覺閾值1.3×103mg/L[30]，所以咸味特征明顯。成品豆豉游離氨基酸中谷氨酸含量最高達到8.232 mg/g，鮮味特征明顯[25,31]。同時谷氨酸在酸性條件下可以與鈉離子結(jié)合形成鮮味濃郁的谷氨酸鈉，鮮味特征得到加強，從而掩蓋了苦味特征，僅僅感覺到味鮮。永川毛霉型豆豉中甜味氨基酸和還原糖及淀粉共同構(gòu)成了其回甜的滋味特點。永川豆豉總酸含量在后發(fā)酵初期增加較快后期較慢，最終達到豆豉成熟時的2.12 g/100 g（以乳酸計）[32]，豆豉中短鏈脂肪酸和乳酸使其呈現(xiàn)一定的酸味，酚類物質(zhì)呈現(xiàn)一定的苦味。這些最終決定了永川毛霉型豆豉特有的咸鮮回甜風(fēng)味特點。

4 結(jié) 論

糖化酶主要來源于制曲過程中的毛霉等真菌，其將淀粉轉(zhuǎn)化為還原糖為后發(fā)酵過程中細菌所利用，同時對豆豉回甘滋味產(chǎn)生發(fā)揮了重要作用。

在豆豉發(fā)酵過程中，總氨基酸含量呈下降趨勢。游離氨基酸增加了33.9 倍，其游離氨基酸占總氨基酸29.5%。成品豆豉的游離氨基酸按含量遞減順序確定的前5 個主要特征氨基酸譜為Glu+Leu+Cys+Phe+Val，這5 種氨基酸占總游離氨基酸的52.11%。在成品豆豉游離氨基酸中，鮮味氨基酸、甜味氨基酸、苦味氨基酸分別占總游離氨基酸的23.98%、12.88%和43.99%。永川豆豉鮮味主要來源于鮮味氨基酸和呈味肽，食鹽也發(fā)揮了呈鮮的作用，同時構(gòu)成了豆豉咸鮮的滋味特點。

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Changes in Total Sugar and Amino Acids, and Formation of Taste Compounds in Yongchuan Douchi during Fermentation

SUO Huayi1,2, ZHAO Xin3, QIAN Yu3, CHEN Juan4, LI Jian4, ZHANG Yu1,2, WANG Yuanwei1, KAN Jianquan1,2,*
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. Chongqing Engineering Research Center of Regional Food, Chongqing 400715, China; 3. Department of Biological and Chemical Engineering, Chongqing University of Education, Chongqing 400067, China; 4. Institute of Qinghai-Tibetan Plateau, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, China)

Yongchuan Douchi, a typical representative of Mucor-type Douchi, is popular among consumers due to its tasty flavor. In this study, the contents of total sugar, reducing sugar, total amino acids and free amino acids and glucoamylase activity in Douchi samples from the traditional fermentation process were determined. The results suggested that the delicious amino acids responsible for the distinct flavor accounted for 23.98% of total free amino acids in refined Douchi. The sweet aftertaste of Douchi mainly was attributed to the combination of the sweet amino acids and reducing sugar. The short-chain fatty acids and lactic acid in Douchi contributed to its sour taste, while phenolic compounds and bitter amino acids were responsible for its bitter taste. All these factors determine the unique flavor and sweet aftertaste of Yongchuan Mucor-type Douchi.

Yongchuan Douchi; total sugar; amino acids; formation of taste compounds

TS214.2

A

1002-6630（2015）21-0100-05

10.7506/spkx1002-6630-201521020

2014-12-11

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（31201411）

索化夷（1978—），男，副教授，博士，研究方向為發(fā)酵微生物。E-mail：birget@swu.edu.cn

*通信作者：闞建全（1965—），男，教授，博士，研究方向為食品科學(xué)。E-mail：ganjq1965@163.com