馮瑞章，龐建義，王 濤 *，游 玲

（1.宜賓學院 發(fā)酵資源與應用四川省高校重點實驗室，四川 宜賓 644000；2.宜賓學院 生命科學與食品工程學院，四川 宜賓 644000）

濃香型白酒的生產(chǎn)依賴于生產(chǎn)環(huán)境內(nèi)眾多微生物的協(xié)同參與。微生物作用下高分子化合物的降解、代謝產(chǎn)物的相互作用是決定白酒產(chǎn)量和品質(zhì)的關(guān)鍵因素[1-3]。糖化酶又稱為淀粉酶（amylase），是葡糖淀粉酶（glucoamylase EC.3.2.1.3）的簡稱，主要由釀造環(huán)境中的霉菌代謝產(chǎn)生[4-6]。因該酶能夠?qū)⒌矸鬯鉃槠咸烟嵌跐庀阈桶拙漆勗熘邪l(fā)揮重要作用，行業(yè)內(nèi)普遍認為淀粉質(zhì)原料糖化發(fā)酵不完全是濃香型白酒產(chǎn)酒率偏低的主要原因[7-9]。隨著白酒工業(yè)的發(fā)展，利用糖化酶作為糖化劑提高白酒出酒率，已被眾多白酒企業(yè)普遍采用[10]。因此，篩選優(yōu)良產(chǎn)糖化酶菌株，對濃香型白酒生產(chǎn)降低能源消耗和生產(chǎn)成本具有重要意義。

本研究對分離自宜賓多糧濃香型白酒曲房空氣的產(chǎn)糖化酶菌株進行篩選，對產(chǎn)酶能力較強的1株菌進行產(chǎn)酶條件研究，以期獲得高產(chǎn)糖化酶的菌株及其適宜的產(chǎn)酶條件，為擴大微生物菌種資源的開發(fā)和微生物糖化酶的生產(chǎn)應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

分離自宜賓濃香型白酒曲房空氣中的14株霉菌菌株，于宜賓學院發(fā)酵資源與應用四川省高校重點實驗室保存。

1.2 培養(yǎng)基

（1）透明圈培養(yǎng)基[11]：可溶性淀粉10g、瓊脂20g、蒸餾水1000L，自然pH值。

（2）發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基[11]：碳源10g、NaNO32g、K2HPO41g、KCl 0.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO4·7H2O 0.01g、蒸餾水1000mL，自然pH值。

1.3 方法

1.3.1 高產(chǎn)糖化酶菌株的篩選

將保存菌株活化后，制備孢子懸液，調(diào)整濃度至107CFU/mL，點接10μL 于透明圈培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)6d，檢測菌落直徑（d）及其周圍透明圈直徑（D）的大小，計算D/d 值，篩選D/d 值最大的1株菌進行酶學特征研究。

1.3.2 菌株糖化酶活力測定

于150mL三角瓶中裝入50mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基，接種1mL濃度為107CFU/mL的孢子懸浮液，30℃、130r/min培養(yǎng)5d，發(fā)酵結(jié)束以后，取發(fā)酵液于離心管中，在6000r/min離心10min，收集上清液即為粗酶液。按照張娥等[12]及MICHELINM等[13]的方法，將糖化酶分離純化。經(jīng)分離純化的糖化酶按照GB 8276—2006《糖化酶制劑》中要求測定[14]。酶活力的定義：在分析條件下，1mL粗酶液1h水解底物釋放出1mg葡萄糖的酶量為1個酶活單位，用U/mL表示[15]。

1.3.3 菌株糖化酶發(fā)酵特征研究

于150mL三角瓶中裝入50mL分別以可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖、乳糖、小麥粉和玉米粉為碳源的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，如1.3.2所述方法接種糖化酶菌株，培養(yǎng)4d后測定糖化酶活力。

1.3.4 初始pH值的影響

于150mL三角瓶中裝入50mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)初始pH值為分別為4、5、6、7、8、9、10，接種糖化酶菌株，培養(yǎng)4d后測定糖化酶活力。

1.3.5 發(fā)酵溫度的影響

于150mL三角瓶中裝入50mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基，接種1mL濃度為107CFU/mL的孢子懸浮液，分別在15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃條件下?lián)u床培養(yǎng)4d，測定糖化酶活力。

1.3.6 溶解氧的影響

同一規(guī)格和型號的150mL三角瓶中盛入不同體積（25mL、50mL、75mL、100mL、125mL）的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，接種糖化酶菌株，培養(yǎng)4d后測定糖化酶活力。

1.3.7 菌株的耐受酒精性

于150mL三角瓶中裝入50mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)酒精度分別為2%vol、5%vol、8%vol、12%vol、16%vol，接種糖化酶菌株，培養(yǎng)4d后測定糖化酶活力。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2003和SPSS13.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行方差分析和顯著性測驗。

2 結(jié)果分析

2.1 高產(chǎn)糖化酶菌株篩選

透明圈直徑（D）、菌落生長直徑（d）及其比值是表征菌株糖化酶能力高低的一個指標。將14株糖化酶菌株分別接種于透明圈固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)6d后（見表1），發(fā)現(xiàn)9株菌可以產(chǎn)生明顯的透明圈（D≥1.60cm），其中J8M-53 菌株產(chǎn)生的透明圈最大（2.70cm），D/d值可達到1.74，說明該菌株產(chǎn)糖化酶能力明顯高于其他菌株。因此，選擇J8M-53菌株作為出發(fā)菌株，進一步研究其產(chǎn)酶條件。

表1 產(chǎn)糖化酶菌株篩選Table 1 Screening of highly glucoamylase-producing strain

2.2 發(fā)酵時間對菌株發(fā)酵產(chǎn)糖化酶活力的影響

將J8M-53菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，考察培養(yǎng)時間對該菌株產(chǎn)糖化酶能力影響，結(jié)果見圖1。隨發(fā)酵時間的延長，糖化酶活性逐漸增加，培養(yǎng)96h后，酶活達到最高值，隨著發(fā)酵時間的繼續(xù)增加，糖化酶活性呈逐漸下降趨勢。值得注意的是，在發(fā)酵初始階段（0～48h），酶活力增加相對緩慢，48h以后，其活性迅速增加，72h和96h時的酶活分別為24h時酶活性的5.8和7.2倍，為48h時酶活性的2.8和3.6倍；在96h～144h時，酶活性降低速度相對緩慢，說明糖化酶發(fā)揮作用的時間段較長。

圖1 菌株產(chǎn)糖化酶動態(tài)Fig.1 The glucoamylase activity trend of J8M-53

2.3 培養(yǎng)條件對菌株發(fā)酵產(chǎn)糖化酶活力的影響

圖2 培養(yǎng)條件對菌株發(fā)酵產(chǎn)糖化酶能力的影響Fig.2 Effects of different culture condition on the glucoamylase activity of J8M-53

由圖2（A）可知，雖然pH值為5.0時菌株產(chǎn)酶效果最好（酶活力為853U/mL），但初始pH值為4.0時，菌株依然有較強的產(chǎn)酶能力（635U/mL），為最大值的74%，說明該菌株有一定的耐酸能力，符合濃香型白酒生產(chǎn)對菌株耐酸性的要求。當初始pH值大于6以后，糖化酶活性急劇降低。

發(fā)酵溫度對菌株糖化酶活性的影響見圖2（B），在一定溫度范圍內(nèi)（15℃～30℃），菌株糖化酶活性與溫度增加呈正相關(guān)，當發(fā)酵溫度為30℃時，糖化酶活性達到峰值，溫度超過這一閾值后，糖化酶活性開始下降，當培養(yǎng)溫度為35℃和40℃時的酶活性分別為最大酶活性的91%和73%，說明該菌株能耐受相對的高溫。

菌株在不同碳源培養(yǎng)條件下糖化酶活性產(chǎn)生明顯差異。由圖2（C）可知，不同碳源條件下糖化酶活性大小依次為可溶性淀粉＞葡萄糖＞蔗糖、小麥粉＞乳糖、玉米粉。雖然小麥粉和玉米粉作為碳源時的糖化酶活性較低，僅分別為最大值的57%和34%，但與其他碳源不同，這兩種物質(zhì)為菌株生長和代謝提供碳源的同時，也是氮源的來源，因此，結(jié)合實際生產(chǎn)，這兩種物質(zhì)發(fā)揮的作用將更為重要。

在不同的裝液量下，菌株都有一定的產(chǎn)酶能力，說明該菌株不是專性好氧或?qū)Ｐ詤捬跷⑸?。由圖2（D）可知，該菌株在裝液量為75mL時表現(xiàn)最大酶活性，且在裝液量為25mL和50mL時的酶活性顯著高于裝液量為100mL、125mL時的酶活性，說明該菌株屬于好氧菌或者兼性厭氧菌，對氧的需求量較大，相對缺氧的環(huán)境將抑制其酶活性的發(fā)揮。

作為濃香型白酒生產(chǎn)中將淀粉水解為葡萄糖的產(chǎn)糖化酶菌株，需要具有一定耐酒精能力。J8M-53菌株產(chǎn)糖化酶的能力大小對低酒精度有一定的依賴性，高酒精濃度則對菌株的產(chǎn)糖化酶能力表現(xiàn)抑制效應。研究菌株產(chǎn)糖化酶活力（y）與發(fā)酵液酒精濃度（x）的相互關(guān)系發(fā)現(xiàn)二者呈現(xiàn)二次函數(shù)關(guān)系（y=-35.803x2+284.23x+542.83，R=0.967）。當酒精濃度為6%vol時糖化酶活性達到最高值（1185U/mL），此后，隨著酒精濃度的增加，糖化酶活力逐漸下降，但當酒精度為12%vol 時，菌株產(chǎn)糖化酶的能力還保持在較高水平，該酒精濃度下的酶活力約為最高酶活力的74%，說明該菌株對酒精具有較高的耐受性。

3 結(jié)論

本研究通過透明圈法從來自濃香型白酒生產(chǎn)環(huán)境的14株真菌中篩選得到1株產(chǎn)糖化酶能力較強的菌株，以液體培養(yǎng)的方式，探索了培養(yǎng)時間對該菌株產(chǎn)糖化酶能力的影響，確定最佳產(chǎn)酶時間為96h。通過單因素試驗研究pH值、培養(yǎng)溫度、碳源及溶解氧對菌株產(chǎn)糖化酶的影響，發(fā)現(xiàn)該菌株產(chǎn)酶的最適初始pH值為5，但在初始pH值為4時糖化酶活性為最大值的74%；最適培養(yǎng)溫度為30℃，但溫度達到40℃時的糖化酶活性最大值的74%；最適的碳源為可溶性淀粉，但對其他碳源都有一定的利用；該菌株屬于好氧菌或者兼性厭氧菌，相對缺氧的環(huán)境將抑制酶活性的發(fā)揮。菌株產(chǎn)糖化酶的能力對培養(yǎng)液的酒精濃度有一定的依賴性，當培養(yǎng)液的酒精濃度為6%vol時，酶活力可以達到1185U/mL，酒精濃度為12%vol時，酶活可以達到873U/mL，約為最大值的74%。

綜上所述，J8M-53菌株具有較好的環(huán)境適應能力，在一定程度上具有耐酸、耐高溫、耐酒精及碳源利用率廣泛的特點。因此，在濃香型白酒生產(chǎn)中，如能合理利用，將在提高濃香型白酒的原料利用率和出酒率方面發(fā)揮重要作用。

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