楊 建，張光宇，杜秀娟，楊玉紅*

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧 沈陽 110161）

羊肚菌屬于子囊菌亞門，是世界著名的野生食（藥）用菌，肉質(zhì)脆嫩鮮美且藥用價(jià)值高，也是一種高級營養(yǎng)滋補(bǔ)品。因其表面有蜂窩狀的可孕頭部，外觀極似羊肚而得名[1-2]。羊肚菌富含蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、維生素、多種礦物質(zhì)及豐富的脂肪酸等，具有增強(qiáng)肌體免疫力、促進(jìn)副腎皮激素的分泌、降低膽固醇、預(yù)防動脈硬化、抗疲勞、抗病毒、抑制肌癌-180等諸多作用，是一味良好的傳統(tǒng)中藥[3-8]。但是羊肚菌人工栽培存在著既要促使子實(shí)體原基形成，又要激發(fā)雙核化菌絲體形成的雙重困難，栽培難度很大[9]，所以至今仍不能進(jìn)行羊肚菌子實(shí)體的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。然而，研究發(fā)現(xiàn)，羊肚菌的菌絲體所含成分以及所具有的功效都與子實(shí)體相似，而且還能較好的保持子實(shí)體獨(dú)特的風(fēng)味，適合液體培養(yǎng)[10]。液體發(fā)酵法生產(chǎn)食用菌的菌絲體要比栽培子實(shí)體簡便快速，許多目前還不能進(jìn)行人工栽培的野生食用菌（如羊肚菌、牛肝菌、松菇、塊菌、雞油菌等）都可以用液體發(fā)酵法來生產(chǎn)菌絲體[11]。這樣一來，菌絲體發(fā)酵技術(shù)便成為解決資源問題的最佳途徑，給羊肚菌的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)開辟了一條新路，而且液體發(fā)酵可以進(jìn)行工業(yè)化的連續(xù)生產(chǎn)，具有規(guī)模大、菌絲體產(chǎn)量高、發(fā)酵周期短、生產(chǎn)效益高等優(yōu)點(diǎn)[12]，所以液體菌絲體的發(fā)酵已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，在食品、醫(yī)藥、保健、化妝品等領(lǐng)域顯示出極大的開發(fā)潛力[13-15]。

研究通過單因素和正交試驗(yàn)，確定羊肚菌的最優(yōu)液體培養(yǎng)基配方和最佳發(fā)酵工藝條件，對系統(tǒng)開發(fā)菌類產(chǎn)品、提高菌類產(chǎn)品的價(jià)值具有重要意義[16]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室保存。

斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨0.5g，牛肉膏0.5g，瓊脂20g，pH值自然，水1000mL。

種子液培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨0.5g，牛肉膏0.5g，pH值自然，水1000mL。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖25g，酵母膏25g，MgSO41g，KH2PO42g，VB12g，pH 6，水1000mL。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-40BI型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器：上海中安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-ICU雙人單面凈化工作臺：浙江蘇凈凈化設(shè)備有限公司；HPX-9082 MBE數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱：上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司；BS-2F振蕩培養(yǎng)箱：常州邁科諾儀器有限公司；LXJ-68-02型離心機(jī)：上海醫(yī)分儀器制造有限公司；DZF-6090型真空干燥箱：上海雙旭電子有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法[17-25]

將馬鈴薯洗凈去皮后，切成小塊煮沸約30min，煮至熟而不爛為止，四層紗布過濾，再配以其他成分，加水定容，混合均勻，分裝在試管中，每只試管約10mL，在121℃滅菌30min，擺斜面放涼備用。將所有與接種有關(guān)的器具在超凈工作臺中通過紫外線殺菌30min后，在無菌環(huán)境下用接種環(huán)挑取于4℃保藏的羊肚菌菌種，轉(zhuǎn)接到新鮮的斜面培養(yǎng)基上，在28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d～7d。

1.3.2 液體種子培養(yǎng)液的制備

按照種子液培養(yǎng)基配方制作培養(yǎng)基，分裝在250mL三角瓶中，滅菌。在無菌條件下，用接種環(huán)從斜面培養(yǎng)基上挑取羊肚菌菌絲體，接入裝有液體種子培養(yǎng)基的三角瓶中，置28℃恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速130r/min，培養(yǎng)5d得一級種子培養(yǎng)液。

1.3.3 液體發(fā)酵培養(yǎng)液的制備

準(zhǔn)確稱取葡萄糖25g，酵母膏25g，MgSO41g，KH2PO42g，VB12g放入1000mL的燒杯中，加入500mL蒸餾水，加熱使其全部溶解，加水定容至1000mL，混合均勻，用量筒量取90mL發(fā)酵液倒入250mL三角瓶中滅菌。放涼后，放入超凈工作臺上并將所有與接種有關(guān)的器具通過紫外線殺菌30min。在無菌條件下，從種子培養(yǎng)液中吸取10mL的種子液加入發(fā)酵培養(yǎng)基中，置28℃恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速130r/min，培養(yǎng)7d。

1.3.4 發(fā)酵培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件的單因素試驗(yàn)

會上，國內(nèi)外專家、果農(nóng)示范戶等就蘋果新品種推廣及產(chǎn)業(yè)發(fā)展、以色列農(nóng)業(yè)水肥一體化應(yīng)用、白水蘋果種植及水肥一體化應(yīng)用等內(nèi)容進(jìn)行了分享，諾貝豐推出的以“深海能”系列水溶肥產(chǎn)品為依托的蘋果種植全程營養(yǎng)解決方案更是受到了與會果農(nóng)的廣泛關(guān)注和歡迎。同時(shí)，會上還舉辦了白水縣商務(wù)局、農(nóng)機(jī)局為農(nóng)村電商托管團(tuán)隊(duì)、機(jī)械化作業(yè)服務(wù)團(tuán)隊(duì)的授旗儀式，這標(biāo)志著白水蘋果產(chǎn)業(yè)又實(shí)現(xiàn)了進(jìn)一步深化發(fā)展。

（1）碳源篩選試驗(yàn)：將液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源葡萄糖分別用等量（25g/L）可溶性淀粉、蔗糖、果糖、麥芽糖替換，培養(yǎng)條件與發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)條件相同，考察不同碳源對羊肚菌菌絲體生物量的影響。

（2）氮源篩選試驗(yàn)：將液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源酵母膏分別用等量（25g/L）蛋白胨、牛肉膏、硫酸銨、硝酸鉀替換，培養(yǎng)條件與發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)條件相同，考察不同氮源對羊肚菌菌絲體生物量的影響。

（3）pH值篩選試驗(yàn)：將液體發(fā)酵培養(yǎng)條件中的pH值分別調(diào)至4、5、6、7、8，培養(yǎng)基成分和其他培養(yǎng)條件與發(fā)酵培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件相同，考察不同pH值對羊肚菌菌絲體生物量的影響。

（4）溫度篩選試驗(yàn)：將液體發(fā)酵培養(yǎng)條件中的發(fā)酵溫度分別調(diào)至22℃、24℃、26℃、28℃、30℃，培養(yǎng)基成分和其他培養(yǎng)條件與發(fā)酵培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件相同，考察不同發(fā)酵溫度對羊肚菌菌絲體生物量的影響。

（5）搖床轉(zhuǎn)速篩選試驗(yàn)：將液體發(fā)酵培養(yǎng)條件中的搖床轉(zhuǎn)速分別調(diào)至110r/min、120r/min、130r/min、140r/min、150r/min，培養(yǎng)基成分和其他培養(yǎng)條件與發(fā)酵培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件相同，考察不同轉(zhuǎn)速對羊肚菌菌絲體生物量的影響。

1.3.5 發(fā)酵培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件優(yōu)化的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過單因素試驗(yàn)，每組選取3個(gè)水平作正交優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)。通過SPSS軟件的方差分析和比較，選取發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的最適發(fā)酵配方和發(fā)酵條件。

1.3.6 測定方法及計(jì)算公式

取發(fā)酵液5000r/min離心10min，棄上清液，所得菌絲體用蒸餾水洗再離心，反復(fù)洗滌離心2～3次后，置于40℃干燥箱中烘干，并稱質(zhì)量，計(jì)算出每200mL發(fā)酵液中的菌絲體生物量（g/200mL）。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件單因素試驗(yàn)

2.1.1 最適碳源的篩選

圖1 不同碳源對羊肚菌菌絲產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of carbon sources on yield ofMorchellamycelium

由圖1可知，羊肚菌菌絲在碳源為葡萄糖、可溶性淀粉、麥芽糖、果糖、蔗糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中均能較好生長，但也存在著明顯差異，菌絲產(chǎn)量順序?yàn)檎崽牵酒咸烟牵究扇苄缘矸郏钧溠刻牵竟牵蕴荚催x取蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉作正交試驗(yàn)。

2.1.2 最適氮源的篩選

由圖2可知，羊肚菌菌絲在氮源為蛋白胨、牛肉膏、硫酸銨、硝酸鉀酵母膏的發(fā)酵培養(yǎng)基中均能較好生長，但也存在著明顯差異，菌絲產(chǎn)量順序?yàn)榕Ｈ飧啵窘湍父啵镜鞍纂耍鞠跛徕洠玖蛩徜@，所以氮源選取蛋白胨、牛肉膏、酵母膏作正交試驗(yàn)。

2.1.3 最適pH值的篩選

由圖3可知，羊肚菌菌絲在pH值為4的時(shí)候，菌絲不生長，而羊肚菌菌絲在pH值為5、6、7、8時(shí)均能生長，但也存在著明顯差異，菌絲產(chǎn)量順序?yàn)閜H 6＞pH 7＞pH 8＞pH 5，所以pH值選取6、7、8作正交試驗(yàn)。

圖2 不同氮源對羊肚菌菌絲產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of nitrogen sources on yield ofMorchellamycelium

圖3 不同pH值對羊肚菌菌絲產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of pH value on yield ofMorchellamycelium

2.1.4 最適溫度篩選

圖4 不同發(fā)酵溫度對羊肚菌菌絲產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on yield ofMorchella mycelium

由圖4可知，羊肚菌菌絲在溫度為22℃、24℃、26℃、28℃、30℃的發(fā)酵條件下均能較好生長，但也存在著明顯差異，菌絲產(chǎn)量順序?yàn)?8℃＞26℃＞24℃＞30℃＞22℃，所以發(fā)酵條件溫度選取24℃、26℃、28℃作正交試驗(yàn)。

2.1.5 最適轉(zhuǎn)速篩選

由圖5可知，羊肚菌菌絲在搖床轉(zhuǎn)速分別為110r/min、120r/min、130r/min、140r/min、150r/min的條件下均能較好生長，但也存在著明顯差異，菌絲產(chǎn)量順序?yàn)?40r/min＞130r/min＞120r/min＞150r/min＞110r/min，所以發(fā)酵條件搖床轉(zhuǎn)速選取120r/min、130r/min、140r/min作正交試驗(yàn)。

圖5 不同搖床轉(zhuǎn)數(shù)對羊肚菌菌絲產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of rotation shaker on yield ofMorchellamycelium

2.2 羊肚菌發(fā)酵培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件優(yōu)化的正交試驗(yàn)

表1 發(fā)酵培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件正交優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Design of orthogonal test for fermentation medium composition and optimization of cultivation conditions

表2 發(fā)酵培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test for fermentation medium composition and cultivation conditions

表3 發(fā)酵培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件正交試驗(yàn)方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal test result for fermentation medium composition and cultivation conditions

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，碳源選取蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉，氮源選取蛋白胨、牛肉膏、酵母膏，再添加MgSO4、KH2PO4、VB1，發(fā)酵條件pH值選取6、7、8，溫度選取24℃、26℃、28℃，搖床轉(zhuǎn)速選取120r/min、130r/min、140r/min，進(jìn)行3個(gè)水平5個(gè)因素的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)（見表1），正交試驗(yàn)的結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。由表2和表3可知，不同組合之間菌絲生物量是不同的，各因素間的極差次序?yàn)榈矗緭u床轉(zhuǎn)速＞發(fā)酵溫度＞pH值＞碳源，極差越大，起的作用就越大，這說明氮源對生物量影響最大，搖床轉(zhuǎn)速次之，從菌絲體生物量來考察各因素水平值，A可取A2，B取B3，C取C2，D取D3，E取E3，因此選定最適合羊肚菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基組合為A2B3C2D3E3，即可溶性淀粉2.5%，酵母膏2.5%，MgSO40.1%，KH2PO40.2%，VB10.2%；最適培養(yǎng)條件pH值為7，發(fā)酵溫度為28℃、搖床轉(zhuǎn)速為140r/min，在最佳條件下所生產(chǎn)的菌絲生物量為3.438g/200mL。

3 結(jié)論

根據(jù)液體培養(yǎng)基的原則和方法，采用單因素試驗(yàn)，優(yōu)選出適合羊肚菌液體培養(yǎng)的碳源、氮源，發(fā)酵條件pH值、發(fā)酵溫度、搖床轉(zhuǎn)速。由羊肚菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件的正交試驗(yàn)可知，最適的發(fā)酵培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件為：可溶性淀粉2.5%，酵母膏2.5%，MgSO40.1%，KH2PO40.2%，VB10.2%；最適培養(yǎng)條件pH值為7，溫度為28℃、搖床頻率140r/min，培養(yǎng)7d，在最佳條件下所生產(chǎn)的菌絲生物量為3.438g/200mL。羊肚菌搖瓶液體發(fā)酵培養(yǎng)參數(shù)為今后開展發(fā)酵罐試驗(yàn)，探索羊肚菌菌絲體規(guī)?；a(chǎn)的工藝條件奠定了基礎(chǔ)。

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