邵麗，王曉，滕振勇（棗莊出入境檢驗檢疫局，山東棗莊277100）

HPLC-柱后光化學衍生法檢測花生醬中黃曲霉毒素

邵麗，王曉，滕振勇
（棗莊出入境檢驗檢疫局，山東棗莊277100）

摘要：建立高效液相色譜-在線柱后光化學衍生-熒光檢測器檢測花生醬中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的含量。樣品以乙腈-水（80∶20）溶液提取，經免疫親和柱凈化后，利用在線柱后光化學衍生-HPLC-FLD進行分析測定。結果：在優(yōu)化條件下，黃曲霉毒素B1、G1在0.30 mg/L～10 mg/L，黃曲霉毒素B2、G2在0.06 mg/L～3.0mg/L線性關系良好，r＞0.998，回收率80%～101%，RSD＜5.9%。黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的檢測限（LOD）分別為0.10、0.03、0.15、0.04μg/kg。

關鍵詞：黃曲霉毒素；花生醬；在線光化學衍生；高效液相色譜

黃曲霉毒素（aflatoxin，AF）主要是由黃曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉（A.parasiticus）產生的一類在自然界中廣泛存在的真菌毒素，較為常見的有AFB1、AFB2、AFG1、AFG2。黃曲霉毒素能使人體或動物的免疫功能喪失，對人體和動物具有強烈致畸、致癌和致突變作用，1993年，黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織（WHO）的癌癥研究機構劃定為I類致癌物。因此，世界各國都對食品中的黃曲霉毒素的含量做出了嚴格的規(guī)定[1-3]。2000年以來我國出口花生和玉米連續(xù)多次由于黃曲霉毒素含量超標而被歐盟額外實施特檢甚至拒絕進口，無論是黃曲霉毒素毒性的嚴重性還是國際貿易的緊迫性，都說明選擇合適的黃曲霉毒素檢測方法是一個亟待解決的重要問題。

目前檢測黃曲霉毒素常用的方法有高效液相色譜．熒光檢測法（HPLC-LD）、液質聯(lián)用（LC-MS/MS）、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）等。由于AFB1和AFG1分子二呋喃結構中碳碳雙鍵吸電子誘導效應，致使分子熒光強度減弱，影響方法靈敏度和檢出限，通過對雙鍵衍生變成飽和碳碳單鍵可增強AFB1和AFG1熒光強度。目前黃曲霉毒素有2種衍生方法，即柱前衍生法和柱后衍生法。柱前衍生法主要有三氟乙酸法和稀鹽酸法，柱后衍生法主要有電化學衍生法、溴法和碘法、三氟乙酸法及光化學衍生法[4-7]。

柱后光化學衍生反應原理是利用環(huán)狀化合物在紫外光照射下能產生熒光這一特性，通過紫外光使流動相中光解出光子，與AFB1和AFG1分子上的活性雙鍵發(fā)生反應，產生了熒光特性更強且更穩(wěn)定的物質，解決了AFB1和AFG1在水溶液中的熒光淬滅現象[8]。

本文采用柱后光化學衍生，建立快速、靈敏、準確、簡單的檢測方法測定花生醬中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2，以適應出入境檢驗檢疫事業(yè)的需要。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

Agilent 1200高效液相色譜儀（四元泵，自動進樣器，配備熒光檢測器）：安捷倫；AURA INDUSTRIES光化學衍生器（15 m衍生線圈，254 nm紫外燈衍生光源）、Afla Test-P黃曲霉毒素免疫親和柱、1.5 μm玻璃纖維濾紙：美國VICAM公司；PT1600E型高速均質攪拌器：德國Polytron公司；N-EVAP112型干式氮吹儀：美國Organomation公司。

AFB1、AFB2、AFG1、AFG2混合對照品溶液（質量濃度分別為1.0、0.3、1.0、0.3 mg/L）：美國SUPELCO公司；甲醇：色譜純；乙腈：色譜純；PBS稀釋液的配制：準確稱取氯化鈉8.0 g、磷酸氫二鈉1.2 g、磷酸二氫鉀0.2 g、氯化鉀0.2 g，用990 mL純水溶解，濃鹽酸調節(jié)pH至7.0，純水稀釋至1 000 mL。

1.2色譜條件

C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5.0 μm），流動相甲醇-水（45∶55），流速1.0 mL/min，進樣量50 μL，柱溫箱30℃。檢測器為熒光檢測器，激發(fā)波長360 nm，發(fā)射波長440 nm。

1.3樣品提取

準確稱花生醬25.0 g，加入NaCl 5 g和乙腈-水（80∶20）125 mL，用高速均質攪拌器（28 000 r/min）攪拌3 min，過濾，量取濾液10 mL，加入PBS 40 mL溶液稀釋，混勻后用玻璃微纖維濾紙過濾，取濾液備用。

1.4免疫親和柱凈化

量取濾液15 mL通過免疫親和柱，上樣前要讓柱子里的保護液完全流盡，樣品過柱時不要加壓，依靠重力過柱，盡量使樣品過柱子的流速放慢，讓樣品中的毒素有足夠的時間和親和柱里面的抗體充分接觸并結合在一起。然后用2×10 mL純凈水淋洗柱子，清洗過程要加壓，加快流速，棄去淋洗液。最后用2 mL色譜乙腈洗脫毒素，收集洗脫液。洗脫時，一定使用純乙腈。充分溫育至少2 min～5 min。將加入的乙腈分2次～3次加入，洗脫不可加壓，流速液一定要放緩。

1.5樣品檢測

將上述毒素洗脫液50℃氮吹至干，用1 mL流動相溶解殘留物，過0.45 μm有機濾膜，轉入進樣瓶，進樣50 μL。按1.2項下色譜條件進行檢測。

2　結果與討論

免疫親和柱是由含有B1、B2、G1、G2 4種黃曲霉毒素的單克隆抗體及其附著載體填充而成的，它是利用免疫化學反應原理，能夠特異地選擇吸附樣品提取液中的4種黃曲霉毒素，使其與其他雜質（如蛋白質、多糖、脂肪等）分離，然后用水將未被免疫親和柱吸附的雜質洗脫，最后再用極性強的溶劑（通常用甲醇）把黃曲霉毒素洗脫下來。由于抗原-抗體反應具有高特異性、高選擇性的特點，因此凈化效果好，檢測靈敏度高，而且操作簡單，快速，省去了大多數方法所采用的多次溶劑萃取凈化步驟，節(jié)省了分析時間。

2.1提取體系的優(yōu)化

黃曲霉毒素檢測一般最常用的提取溶劑為甲醇-水溶液，不同比例的氯仿-水溶液和乙腈-水溶液也可作為提取黃曲霉毒素的溶劑系統(tǒng)。本研究對提取體系進行了優(yōu)化選擇，分別選用乙腈/水（80+20，體積比）、甲醇/水（60+40，體積比）兩種提取溶劑；2∶1、4∶1、6∶1三種溶劑/試樣比（mL/g）；振蕩與高速均質兩種提取方式進行了試驗。結果顯示以乙腈/水（80+20）作為提取劑，以4∶1（mL/g）的溶劑/試樣比，以高速均質3 min為提取方式的提取體系效果最為理想。

2.2標準曲線

取適量黃曲霉毒素對照品儲備液，用甲醇∶苯（2∶98）稀釋得濃度分別為0.02、0.05、0.1、0.3、0.5、1.0 μg/mL的對照品溶液，過0.45 μm有機濾膜，進樣檢測。以濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程，結果見表1。

表1 黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的線性回歸方程、相關系數、線性范圍Table 1　Regression equations，correlation coefficients，linear rang of aflatoxins

2.3最低檢測限和定量限

將黃曲霉毒素混合儲備液稀釋至較低濃度，根據信噪比S/N=3和S/N=10時相應的濃度確定被測物質的最低檢測限和定量限，AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的檢測限分別為0.10、0.03、0.15、0.04 μg/kg，定量限分別為0.30、0.10、0.40、0.10 μg/kg。

2.4精密度和重復性試驗

配制濃度分別為0.1、0.05、0.1、0.05 μg/mL的AFB1、AFB2、AFG1、AFG2混合對照品溶液，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。AFB1、AFB2、AFG1、AFG2峰面積的RSD分別為0.52%、0.69%、2.11%、1.63%、表明儀器精密度良好。

取陰性樣品添加黃曲霉毒素標準溶液，按1.4項下方法平行制備6份樣品溶液，進樣檢測，記錄峰面積。計算6份樣品中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2峰面積的RSD<5.20%。

2.5回收率試驗

本方法的回收率試驗是在未檢出黃曲霉毒素的花生醬中，添加黃曲霉毒素標準溶液，添加水平為如下。AFB1，AFG1的3個添加水平分別為10.0、5.0、1.0 μg/kg，AFB2和AFG2的3個添加水平分別為3.0、1.5、0.3 μg/kg。按照1.4制備供試品溶液，分析測定，結果見表2。

表2　樣品中黃曲霉毒素回收率（n=3）Table 2　Recoveries of aflatoxins in samples（n=3）

2.6柱后光衍生熒光-檢測色譜圖

黃曲霉毒素混合標準溶液和花生醬加標處理后，HPLC-柱后光衍生-熒光檢測的分析結果如圖1所示。

圖1　AFT混合標準溶液（a）和花生醬加標樣品（b）的色譜圖Fig.1　Chromatogram of a mixture of standards（a）and a peanut butter sample（b）spiked with AFT

由圖1可知，AFB1、AFB2、AFG1、AFG2與相鄰峰的分離度均大于1.5。

3　結論

采用免疫親和柱法結合柱后電化學衍生高效液相色譜法，檢測花生醬中的AFB1、AFB2、AFG1、AFG2，方法的檢出限分別為0.10、0.03、0.15、0.04 μg/kg，定量限分別為0.30、0.10、0.40、0.10 μg/kg，相對標準偏差2.70%～5.28%，回收率80%～101%。該方法采用免疫親和柱吸附試樣中的雜質，凈化操作一步完成，采用柱后光照衍生，操作簡單，為黃曲霉毒素的檢測提供一套簡單易行、高靈敏度的檢測方案，適用于出入境工作中大批量花生醬樣品的檢測需要。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.23.036

收稿日期：2014-06-12

作者簡介：邵麗（1982—），女（漢），工程師，碩士研究生，主要從事出入境食品檢測工作。

Determination of Aflatoxin B1，B2，G1 and G2 in Peanut Butter by HPLC with On-Line Post-Column Photochemical Derivatization

SHAO Li，WANG Xiao，TENG Zhen-yong
（Zaozhuang Exit-Entry Inspection and Quarantine Burau，Zaozhuang 277100，Shandong，China）

Abstract：To determine the contents of aflatoxin B1，B2，G1 and G2 in peanut butter using on-line post-column photo-chemical derivatization-HPLC-FLD method.The samples were extracted with acetonitril-H2O（80∶20）and purified with inmunoafinity column，aflatoxins were analyzed by HPLC-FLD with post-column photochemical derivatizaton.On optimum conditions，aflatoxin B1，G1 ranging 0.30 mg/L-10 mg/L showed a good linear relationship with aflatoxin B2，G2 ranging 0.06 mg/L-3.0mg/L with r＞0.998．The recoveries ranged between 80%and 101%，with RSDs all bellow 5.9%．LOD of aflatoxin B1，B2，G1 and G2 were 0.10，0.03，0.15，0.04 μg/kg，respectively.

Key words：aflatoxins；peanut butter；on-line photochemical derivatization；HPLC