孫秀萍，趙兵，王曉東（中國科學(xué)院過程工程研究所，北京100080）

中國被毛孢液體發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化

孫秀萍，趙兵，王曉東*
（中國科學(xué)院過程工程研究所，北京100080）

摘要：以中國被毛孢為試驗(yàn)菌株，對藥瓶發(fā)酵培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果表明最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方：葡萄糖3%，蠶蛹粉2%，土豆20%，KH2PO40.2%，MgSO40.1%，水解酪蛋白0.1%，復(fù)合維生素0.07%。最佳搖瓶發(fā)酵條件：初始pH 6.5，裝液量100 mL/500 mL，接種量為5%，溫度為16℃，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min。菌絲體干重為16.53 g/L，腺苷含量為1.85 mg/g。與優(yōu)化前相比，菌絲體干重提高了36.2%，腺苷含量提高了46.8%。

關(guān)鍵詞：中國被毛孢；液體發(fā)酵；優(yōu)化；腺苷含量

中藥冬蟲夏草為真菌界（Fungi）麥角菌科（Clvaieipiacteae）冬蟲夏草屬（Cordyceps）的冬蟲夏草菌（C.sinensis（Berk．）Sacc．）寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座及幼蟲尸體的復(fù)合體[1]。主產(chǎn)于四川、青海、西藏、云南、貴州等海拔3 500 m～5 000 m的高山草甸土中[2]。由于具有多種醫(yī)療作用，其需求量逐年增加，野生資源遭到掠奪式采集，瀕臨枯竭。梁宗琦、李增智等的研究表明，中國被毛孢（Hirsutella sinensis）是冬蟲夏草的真菌無性型[3-6]。且研究發(fā)現(xiàn)，人工發(fā)酵冬蟲夏草無性型得到的菌絲體與天然冬蟲夏草化學(xué)組成及藥理學(xué)作用基本一致，可用來代替天然冬蟲夏草生產(chǎn)蟲草制品，彌補(bǔ)自然資源的短缺[7-8]。腺苷作為冬蟲夏草的主要有效成分之一，已收錄入藥典。為了提高液體發(fā)酵蟲草的產(chǎn)量，本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)，以菌絲體干重和腺苷含量為指標(biāo)，對中國被毛孢菌絲體液體發(fā)酵的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)菌株

中國被毛孢菌種：購自貴州益生原生物技術(shù)有限公司，從青海天然冬蟲夏草中分離得到。

1.1.2培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基；種子培養(yǎng)基：葡萄糖2%，蛋白胨1%，土豆20%，KH2PO40.2%，MgSO40.1%，水解酪蛋白0.1%，復(fù)合維生素0.1%，pH 5.5～6.0；原液體培養(yǎng)基（基礎(chǔ)培養(yǎng)基）：葡萄糖2%，蛋白胨1%，土豆20%，KH2PO40.2%，MgSO40.1%，水解酪蛋白0.1%，復(fù)合維生素0.1%，pH 5.5～6.0。初始培養(yǎng)條件：轉(zhuǎn)速150 r/min，培養(yǎng)溫度為17℃，接種量為5%。

1.1.3試劑

腺苷標(biāo)準(zhǔn)品：購自中國食品藥品檢定研究院，純度＞98%。

1.2方法

1.2.1母種和種子液的制備

1.2.1.1母種的制備

在超凈臺中將菌絲體接種至固體斜面后，放入17℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至菌種長滿整個(gè)斜面后再放入4℃的冰箱中儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2種子液的制備

在超凈臺中將母種挑取一塊轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基中，放入17℃的搖床中，培養(yǎng)7 d～10 d。

1.2.2中國被毛孢的菌體生長曲線

取液體培養(yǎng)72 h的種子液，以5%接種量接入基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，在溫度為17℃和轉(zhuǎn)速為150 r/min的搖床中培養(yǎng)，每隔24 h取樣測定菌絲體干重和腺苷得率，得到生長曲線，對菌體進(jìn)行生長規(guī)律初步探索。

1.2.3菌體干重的測定方法

在超凈臺中，從搖瓶中取出10 mL的樣品，在10 000 r/min下離心20 min，去上清液，將離心管中的菌絲轉(zhuǎn)移到已稱取重量的培養(yǎng)皿中，放于48℃的烘箱中烘干至恒重，然后取出稱取樣品和皿重，總重減去皿重即可得到菌絲體的重量。然后將皿中的菌絲收集于1.5 mL的離心管中置于4℃的冰箱中，留待以后測定樣品中的有效成分。

1.2.4.2腺苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

精密稱取腺苷標(biāo)準(zhǔn)品0.25、0.5、1、2、3、4、5 mg，分別置于50 mL容量瓶中，加100%甲酵溶液使溶解并稀釋至刻度，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖，計(jì)算峰面積值，以峰面積對濃度進(jìn)行回歸，得到回歸方程。

1.2.4.3樣品中腺苷含量測定

用分析天平精確稱取菌絲體干粉0.100 0 g置于15 mL的離心管中，加入4 mL的去離子水，混勻，在100 W、40 KHz及35℃的超聲清洗儀器中進(jìn)行細(xì)胞破碎30 min。將離心管在7 000 r/min的條件下離心6 min，棄沉淀將上清液定容至5 mL。按照上述液相條件進(jìn)行液相分析，從而求得腺苷的含量。

1.2.5碳源對菌種發(fā)酵的影響

1.2.5.1碳源種類對菌種發(fā)酵的影響

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中去除葡萄糖，分別選用等量的葡萄糖、可溶性淀粉、白砂糖（食用級）、乳糖為碳源，第5天取樣10 mL測其菌絲體干重和腺苷的得率以確定最佳碳源。

1.2.5.2碳源含量對菌種發(fā)酵的影響

選用葡萄糖來探究碳源含量對菌絲體發(fā)酵的影響，葡萄糖濃度依次為0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%，其他條件不變，第5天取樣10 mL測其菌絲體干重和腺苷得率來確定碳源的最佳濃度。

1.2.6氮源對菌種發(fā)酵的影響

1.2.6.1氮源種類對菌種發(fā)酵的影響

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中去除蛋白胨，分別選用等量的有機(jī)氮源蠶蛹水（取蠶蛹粉煮30 min，經(jīng)四層紗布過濾得到蠶蛹水）、牛肉膏、蛋白胨、酵母粉和無機(jī)氮源硫酸銨為氮源，第5天取樣10 mL測其菌絲體干重和腺苷得率來確定最佳氮源。

1.2.6.2氮源含量對菌種發(fā)酵的影響

選用蛋白胨做氮源含量試驗(yàn)，蛋白胨濃度依次為0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%，第5天取樣10 mL測其菌絲體干重和腺苷得率來確定氮源的最佳濃度。

1.2.7溫度對菌種發(fā)酵的影響

溫度是發(fā)酵過程中重要的影響因素，由于微生物的生長和產(chǎn)物的合成都是在各種酶的催化下進(jìn)行的，而溫度是保證酶活性的重要條件，因此發(fā)酵系統(tǒng)中，必須保證穩(wěn)定而合適的溫度環(huán)境。本研究設(shè)定發(fā)酵溫度分別為13、15、16、17、18、21、25℃，其他條件不變，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上以菌絲體收率為指標(biāo)第4天取樣10 mL，從而得到最適發(fā)酵溫度。

1.2.8不同起始pH對菌體發(fā)酵的影響

pH對于微生物的生長非常重要，它能影響微生物細(xì)胞膜內(nèi)外兩側(cè)的電位及物質(zhì)輸送等，為了確定中國被毛孢合適的生長pH，設(shè)定了起始pH分別為3、4、5、5．5、6、6．5、7、7．5、8、9進(jìn)行發(fā)酵，第4天取樣10 mL測其菌絲體收率，從而得到最適起始pH。

1.2.9復(fù)合維生素含量對菌體發(fā)酵的影響

有文獻(xiàn)報(bào)道，培養(yǎng)基中維生素的含量會影響菌絲體生長。為了確定合適的復(fù)合維生素含量，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，設(shè)定不同的復(fù)合維生素含量0、0.01%、0.03%、0.05%、0.07%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%進(jìn)行發(fā)酵，第5天取樣10 mL測定菌絲體收率和腺苷得率，以確定合適的復(fù)合維生素含量。

1.2.10發(fā)酵培養(yǎng)基的正交試驗(yàn)

在生產(chǎn)實(shí)踐和科學(xué)實(shí)驗(yàn)中，為了實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、低消耗，往往要通過試驗(yàn)來尋找最優(yōu)工藝條件，常用的方法是采用正交試驗(yàn)。為確定菌種搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳配方，將葡萄糖含量、蠶蛹粉含量、pH、復(fù)合維生素含量作為A、B、C、D四因素，每個(gè)因素取3個(gè)水平，以L9（34）正交表設(shè)計(jì)試驗(yàn)，3次平行。試驗(yàn)結(jié)果采用正交軟件進(jìn)行分析，從而得到最佳發(fā)酵培養(yǎng)基的配方。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1　The design of orthogonal experiment

2　結(jié)果與分析

2.1菌體生長曲線

每隔24 h取一次樣，然后測定菌絲體的干重和腺苷含量，制作菌絲體的生長曲線。

圖1 中國被毛孢生長曲線Fig.1　Growth curve of Hirsutella sinensis

從圖1可以看出，從0至12 h為適應(yīng)期，12 h至72 h為對數(shù)生長期，72 h至216 h為穩(wěn)定生長期，而且當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為96 h時(shí)，菌絲體收率最大，此后菌絲體的干重變化不大，直至菌絲體生長至240 h，菌絲體干重有所下降。腺苷含量隨著發(fā)酵的進(jìn)行迅速增加，當(dāng)生長到120 h之后腺苷含量達(dá)到最大，隨后腺苷含量緩慢下降，初步估計(jì)是培養(yǎng)基中的氮源不足以滿足菌種生長的需要，而腺苷開始作為氮源使用，而當(dāng)腺苷等含氮物質(zhì)消耗殆盡時(shí)，菌絲體的含量也開始出現(xiàn)了明顯的下降。

2.2腺苷含量的測定

腺苷為冬蟲夏草的重要質(zhì)控指標(biāo)，藥典中規(guī)定其含量不得少于0.01%，腺苷標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖如圖2，蟲草菌絲體樣品的色譜圖如圖3。

圖2腺苷標(biāo)準(zhǔn)品的HPLCFig.2　HPLC of standard sample of adenosine

圖3菌絲體的HPLC Fig.3　HPLC of mycelia

通過對比標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的譜圖可以得到相對應(yīng)的腺苷峰。以濃度X和峰面積Y進(jìn)行回歸，得到腺苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖4。

圖4腺苷標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4　The standard curve of adenosine

回歸方程為：Y=47 417X-182 835，r2=0.9964>r0.014= 0.917，表明X和Y相關(guān)關(guān)系極顯著。

2.3單因素試驗(yàn)

2.3.1碳源對菌體發(fā)酵的影響

2.3.1.1碳源種類的影響

保證原液體培養(yǎng)基中其它成份不變，改變培養(yǎng)基中碳源的種類，經(jīng)過搖瓶發(fā)酵以確定中國被毛孢生長的最適碳源。碳源種類對菌絲體發(fā)酵的影響如圖5。

圖5　碳源種類對菌絲體發(fā)酵的影響Fig.5　The effect of different carbons on the fermentation of mycelia

由圖5可以得出，葡萄糖和可溶性淀粉作為碳源時(shí)，菌絲體干重要比白砂糖和乳糖作為碳源時(shí)高；而葡萄糖作為碳源時(shí)腺苷含量要比其他幾種碳源高。綜合考慮，選用葡萄糖作為碳源。

2.3.1.2碳源含量對菌絲體發(fā)酵的影響

保證原液體培養(yǎng)基中其它成份不變，改變培養(yǎng)基中葡萄糖的含量，經(jīng)過搖瓶發(fā)酵后，確定中國被毛孢生長的最適碳源含量，試驗(yàn)結(jié)果見圖6。

圖6　碳源含量對菌絲體發(fā)酵的影響Fig.6　The effect of concentration of carbon on the fermentation of mycelia

由圖6可看出，菌絲體的干重和腺苷含量均隨著發(fā)酵時(shí)間，先增大后又減少，其中在葡萄糖含量為3.00%時(shí)菌絲體干重和腺苷含量均達(dá)到最大，故葡萄糖含量為3.00%時(shí)對菌絲體發(fā)酵最有利。

2.3.2氮源對菌體發(fā)酵的影響

2.3.2.1氮源種類對菌絲體發(fā)酵的影響

保證原液體培養(yǎng)基中其它成份不變，改變培養(yǎng)基中氮源的種類，經(jīng)過搖瓶發(fā)酵后，確定了中國被毛孢生長的最適碳源，試驗(yàn)結(jié)果見圖7。

圖7　氮源種類對菌絲體發(fā)酵的影響Fig.7　The effect of different nitrogens on the fermentation of mycelia

由圖7可以得出，有機(jī)氮源要比無機(jī)氮源更有利于菌體的生長。蠶蛹粉作為氮源時(shí)，菌絲體干重最高；蠶蛹粉和牛肉膏作為氮源時(shí)，氮源含量略高于酵母粉，但遠(yuǎn)高于蛋白胨和硫酸銨。綜合考慮，選用蠶蛹粉作為氮源。

2.3.2.2氮源含量對菌絲體發(fā)酵的影響

保證原液體培養(yǎng)基中其它成份不變，改變培養(yǎng)基中蠶蛹粉的含量，經(jīng)過搖瓶發(fā)酵后，確定中國被毛孢生長的最適氮源含量，試驗(yàn)結(jié)果見圖8。

圖8　氮源含量對菌絲體發(fā)酵的影響Fig.8　The effect of concentration of nitrogen on the fermentation of mycelia

由圖8可看出，菌絲體的干重和腺苷含量均隨著發(fā)酵時(shí)間，先增大后又減少，其中在蠶蛹粉含量為3.00%時(shí)菌絲體干重達(dá)到最大，在蠶蛹粉含量為2.50%時(shí)腺苷含量達(dá)到最大。

2.3.3起始pH對菌絲體發(fā)酵的影響

為了確定菌種生長的合適pH，采用了不同的起始pH，試驗(yàn)結(jié)果見圖9。

由圖9可以看出，隨著起始pH升高，菌絲體收率先增加又降低，當(dāng)起始pH為6.5時(shí)，菌絲體收率最高，pH高于7.5時(shí)，菌絲體收率明顯下降，所以培養(yǎng)時(shí)選擇起始pH為6.5；從發(fā)酵結(jié)束后的pH看，菌種對于堿性的調(diào)節(jié)能力非常強(qiáng)，可以從起始pH的9.0調(diào)節(jié)到6.5，但對酸性較強(qiáng)時(shí)的調(diào)節(jié)能力較差，其中起始pH為4.0和5.0的搖瓶經(jīng)過發(fā)酵后分別變?yōu)?.08和5.25，pH幾乎不變化，但當(dāng)pH為5.5以上時(shí)，最終pH又能調(diào)節(jié)至6左右。

圖9　不同起始pH對菌絲體干重的影響Fig.9　The effect of initial pH on the yield of mycelia

2.3.4溫度對菌絲體發(fā)酵的影響

溫度對菌絲體發(fā)酵的影響見圖10。

圖10　菌絲體干重隨溫度的變化Fig.10　The effect of different temperature on the yield of mycelia

由圖10可以看出，菌絲體干重隨著溫度的升高先增大后減小，菌絲體干重在15℃～17℃之間差距不大，最終確定菌種的發(fā)酵溫度為16℃，此時(shí)菌絲體的收率達(dá)到最大。

2.3.5復(fù)合維生素含量對菌體發(fā)酵的影響

復(fù)合維生素含量對菌體發(fā)酵的影響見圖11。

由圖11可以看出隨著復(fù)合維生素含量的增加，菌絲體干重和腺苷含量先增加后減少，并且在0.07%時(shí)達(dá)到最大值。

2.4正交試驗(yàn)

為確定菌種搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳配方，在以上的單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取對腺苷含量影響明顯的因素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。最后選取葡萄糖含量、蠶蛹粉含量、pH、復(fù)合維生素含量作為A、B、C、D四因素，每個(gè)因素取三個(gè)水平，以L9（34）正交表設(shè)計(jì)試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果采用DPS數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行分析，從而得到最佳發(fā)酵培養(yǎng)基的配方。正交試驗(yàn)見表2，方差分析見表3。

圖11　復(fù)合維生素含量對菌絲體發(fā)酵的影響Fig.11　The effect of concentration of multivitamin on fermentation of mycelia

表2　正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析表Table 2　Results of orthogonal experiment and analysis of its range

表3　正交試驗(yàn)的方差結(jié)果分析表Table 3　Analysis of variance of the orthogonal experiment

從表2極差大小可以看出，影響腺苷含量的各因素主次順序?yàn)椋篈＞D＞C＞B。方差分析數(shù)據(jù)表3可得，F(xiàn)碳源含量＞F0.10=3.11，可見A因素對腺苷含量影響顯著，所以對該因素應(yīng)控制在最優(yōu)水平上。而B、D、C因素F氮源含量＜FpH＜F復(fù)合維生素含量＜F0.10=3.11，即B、C、D對腺苷含量影響不顯著，對結(jié)果影響不大。綜合以上分析，得到最佳培養(yǎng)基配方為A2B2C3D2。因在正交試驗(yàn)中9組實(shí)驗(yàn)中沒有A2B2C3D2的組合，所以補(bǔ)做了這組實(shí)驗(yàn)，得到的腺苷含量為1.9388 mg/g，確實(shí)高于其它組合，故最終確定的最佳培養(yǎng)基配方為：葡糖糖含量為20 g/L，蠶蛹粉含量含量為30 g/L，pH為6.5，復(fù)合維生素含量0.7 g/L。

2.5優(yōu)化培養(yǎng)基與基礎(chǔ)培養(yǎng)基比較

優(yōu)化培養(yǎng)基與基礎(chǔ)培養(yǎng)基比較見表4。

表4　優(yōu)化培養(yǎng)基與基礎(chǔ)培養(yǎng)基對比Table 4　Comparison of optimized medium and initial medium

由表4可以看出，通過搖瓶培養(yǎng)的優(yōu)化，菌絲體干重和腺苷含量均有了顯著的提高，菌絲體干重高了36.2%，腺苷含量提高了46.8%。

3　結(jié)論

1）單因素試驗(yàn)結(jié)果表明：最佳氮源為蠶蛹粉，最佳碳源為葡萄糖，發(fā)酵初始pH為6．5，裝液量100 mL/ 500 mL，接種量為5%，溫度為16℃，復(fù)合維生素的含量以0.07%為最佳。

2）在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了正交試驗(yàn)，結(jié)果表明最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：葡萄糖3%，蠶蛹粉2%，土豆20%，KH2PO40.2%，MgSO40.1%，水解酪蛋白0.1%，復(fù)合維生素0.07%。最佳搖瓶發(fā)酵條件：初始pH6.5，裝液量100 mL/500 mL，接種量為5%，溫度為16℃，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min。

3）在優(yōu)化后的最佳培養(yǎng)條件下中國被毛孢菌絲體干重為16.53 g/L，腺苷含量為1.85 mg/g，與優(yōu)化前的菌絲體干重12.14 g/L和腺苷含量1.26 mg/g相比，菌絲體干重高了36.2%，腺苷含量提高了46.8%?？梢?，通過培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件的優(yōu)化，使得菌絲體干重和腺苷含量都有了明顯的提高。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.23.042

收稿日期：2014-02-25

作者簡介：孫秀萍（1988—），女（漢），碩士，主要從事微生物發(fā)酵研究。

*通信作者：王曉東，中科院副研究員。

Optimization of Liquid Fermentation Conditions of Hirsutella Sinensis

SUN Xiu-ping，ZHAO Bing，WANG Xiao-dong*
（Institute of Progress Engineering，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100080，China）

Abstract：This study took the Hirsutella sinensis as the experimental strain，and optimized its medium component of the shaking flask fermentation and ferment condition.The results of orthogonal experiment，which was based on the results of signal factor experiment，were as follows.The optimal medium component：glucose was 3%，silkworm chrysalis powder was 2%，potato was 20%，KH2PO4was 0.2%，MgSO4was 0.1%，hydrolysis casein was 0.1%，multivitamin was 0.07%.The optimal fermentation condition：initial pH 6.5，liquid volume in flask was 100 mL/500 mL，inoculum concentration was 5%，the temperature was 16℃，shaker's rotating speeds was 150 r/min.Based on this medium and ferment condition，the mycelium yield was 16.53 g/L and the content of adenosine was 1.85 mg/g.Compared to the original ferment condition，the mycelium yield and content of adenosine increased by 36.2%and 46.8%，respectively.

Key words：Hirsutella sinensis；liquid fermentation；optimization；content of adenosine