鐘志越，李　炳，劉　明，李宏治，梁曉俊，申　捷(復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院化學(xué)傷害救治中心ICU，上海201508)

醒腦靜注射液對全腦缺血再灌注大鼠血腦屏障ZO-1表達(dá)的影響*

鐘志越，李炳，劉明，李宏治，梁曉俊，申捷△
(復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院化學(xué)傷害救治中心ICU，上海201508)

［摘要］目的:探討醒腦靜( XNJ)注射液對大鼠全腦缺血再灌注后血腦屏障通透性及緊密連接蛋白1( ZO-1)表達(dá)的影響。方法:采用改良Pulsinelli四血管閉塞法建立大鼠全腦缺血再灌注模型。將雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為4組，即假手術(shù)組、全腦缺血再灌注模型組、溶劑對照組和XNJ組。每組均在缺血再灌注后24 h、48 h和72 h處理。用干濕重法測定腦組織中水含量，分光光度計法檢測腦組織伊文思藍(lán)( EB)含量，Western blot檢測大腦皮層的ZO-1蛋白含量。結(jié)果:缺血再灌注后24 h，模型組、溶劑對照組和XNJ組的腦組織含水量均顯著高于假手術(shù)組( P＜0.05)，但在缺血再灌注后48 h和72 h，模型組和溶劑對照組腦組織含水量顯著高于XNJ組和假手術(shù)組( P＜0.05)。缺血再灌注后24 h，模型組、溶劑對照組和XNJ組大鼠腦組織內(nèi)EB含量均高于假手術(shù)組( P＜0.05)，缺血再灌注后48 h和72 h，假手術(shù)組和XNJ組的EB含量顯著低于模型組和溶劑對照組( P＜0.05)。缺血再灌注后24 h，模型組、溶劑對照組和XNJ組大鼠腦皮層中的ZO-1蛋白表達(dá)水平顯著低于假手術(shù)組( P＜0.05)，同樣缺血再灌注后48 h和72 h，假手術(shù)組和XNJ組皮層中ZO-1蛋白含量顯著高于模型組和溶劑對照組( P＜0.05)。結(jié)論:在缺血再灌注后的48 h和72 h，醒腦靜注射液對血腦屏障具有保護(hù)作用，可能與醒腦靜注射液上調(diào)ZO-1蛋白的表達(dá)有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］醒腦靜注射液;缺血再灌注;血腦屏障;緊密連接蛋白1

腦缺血再灌注往往造成一系列嚴(yán)重的病理生理性損傷。腦缺血后的腦水腫［1－2］包括細(xì)胞毒性( cytotoxic)和血管源性( vasogenic) 2種，前者在缺血期間已啟動，屬細(xì)胞內(nèi)水腫，在再灌注后可繼續(xù)加重。當(dāng)缺血達(dá)到一定時限，腦血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，血腦屏障( blood-brain barrier，BBB)受損，腦毛細(xì)血管通過性增加，血漿蛋白與水分外溢，細(xì)胞外液增加，造成間質(zhì)性腦水腫，即謂血管源性腦水腫。因此腦缺血再灌注后所導(dǎo)致的血腦屏障的破壞以及通透性的增大是導(dǎo)致腦水腫及腦損傷的重要環(huán)節(jié)［3］。目前在臨床上應(yīng)對腦缺血再灌注損傷，有效控制腦水腫，減少血腦屏障的滲漏，是治療成功的關(guān)鍵。醒腦靜( Xingnaojing，XNJ)是在安宮牛黃丸的基礎(chǔ)上精制而成的一種注射液，主要配方為麝香、郁金、冰片、梔子，具有清熱解毒，涼血活血，開竅醒腦之效，對于腦缺血再灌注損傷有很好的療效［4］，但對其治療機(jī)制并未進(jìn)行深入研究。本研究的目的就是從腦缺血再灌注損傷后的腦水腫入手，探討醒腦靜對血腦屏障的影響，尤其是對血腦屏障緊密連接的主要構(gòu)成成分緊密連接蛋白1( zonula occludens-1，ZO-1)表達(dá)的影響。

材料和方法

1材料

1.1實驗動物與分組健康成年雄性Wistar大鼠216只，體重200～250 g，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供。隨機(jī)分為4組，每組54只:即假手術(shù)組( sham group) ;全腦缺血再灌注模型組( model group) ;全腦缺血再灌注+溶劑對照組( solvent group) ;全腦缺血再灌注+醒腦靜干預(yù)組( XNJ group)。每組又分3個時點即再灌注后24 h、48 h和72 h進(jìn)行處理，每個觀察點18只，分別進(jìn)行腦組織中水含量測定、伊文思藍(lán)( Evans blue，EB)染色及ZO-1蛋白檢測。

1.2主要試劑與設(shè)備醒腦靜注射液(無錫濟(jì)民可信山禾藥業(yè)股份有限公司) ; EB購自Sigma; ZO-1 I 抗( Abcam) ; Epoch酶標(biāo)儀( BioTek)。

2方法

2.1大鼠全腦缺血再灌注模型的制備采用改良Pulsinelli四血管閉塞法［5］。10%水合氯醛麻醉，大鼠固定于操作臺，頸后備皮、消毒，于第1頸椎水平作1～2 cm的縱形切口，分離筋膜、肌肉，暴露第1頸椎翼突孔，電凝雙側(cè)椎動脈造成椎動脈永久性閉塞，消毒縫合切口。翻轉(zhuǎn)大鼠仰臥位固定，于頸前正中作切口，分離雙側(cè)頸總動脈，穿線打一活結(jié)埋于皮下備用，消毒縫合。24 h后不行麻醉固定，用無損傷微動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈持續(xù)10 min，造成大鼠全腦缺血。出現(xiàn)瞳孔散大、翻正反射消失立即撤去動脈夾恢復(fù)腦血流，消毒縫合切口。

2.2給藥模型完成后立即腹腔注射醒腦靜注射液10 mL·k g－1·d-1( XNJ組) ;而solvent組于模型完成后立即腹腔注射同等量的生理鹽水; model組不給予干預(yù); sham組完成切口，分離但不結(jié)扎和凝閉血管。

2.3干濕重法測定腦組織中水含量［6］各組大鼠麻醉后，立即斷頭取腦，經(jīng)電子天平精確稱重后，放入110℃恒溫干燥箱烘烤24 h至恒重( 2次稱重差別＜0.2 mg)后，用同一電子天平再精確稱干腦組織重量，并按照Eliot干濕重法計算腦組織含水量，以百分率表示。腦含水量( %) = (濕重－干重) /濕重×100%。

2.4伊文思藍(lán)染色檢測血腦屏障通透性參照文獻(xiàn)［7］的方法進(jìn)行，從大鼠尾靜脈注入2%的EB溶液( 5 mL/kg體重)，5 h后麻醉左心室灌注生理鹽水300 mL，取腦，做2 mm厚冠狀切片，并用電子天平分別精確稱其濕重后，置于二甲基甲酰胺溶液，37℃水浴48 h取出，5 000 r/min離心取上清液，并再次離心取200 μL上清液加入酶標(biāo)板中，酶標(biāo)儀用波長632 nm測定吸光度。稱取EB 4 mg，加生理鹽水至總?cè)莘e25 mL，取0.3 mL加入5.7 mL二甲基甲酰胺中混勻作為第1管;倍比稀釋得濃度依次為8 mg/L、4 mg/L、2 mg/L、1 mg/L、0.5 mg/L和0.25 mg/L。37℃水浴孵育48 h后比色(λ= 632 nm)測定吸光度，制作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.5Western blot檢測ZO-1蛋白含量各組大鼠麻醉取腦后，取皮層腦組織勻漿后提取總蛋白，測濃度后，進(jìn)行SDS-PAGE，然后轉(zhuǎn)膜，經(jīng)兔抗鼠I抗孵育后，加II抗孵育，化學(xué)發(fā)光后壓片曝光，SYNGENE生物圖像系統(tǒng)拍照及數(shù)據(jù)處理。

3統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤( mean±SEM)表示，應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計，采用單因素方差分析( one-way ANOVA)和隨機(jī)區(qū)組的t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 各組大鼠在缺血再灌注后24 h、48 h和72 h腦組織中的含水量

結(jié)果如表1所示，缺血再灌注后24 h，模型組、溶劑對照組和XNJ組的腦組織含水量均高于假手術(shù)組( P＜0.05)。缺血再灌注后48 h和72 h，模型組和溶劑對照組的腦組織含水量開始顯著高于假手術(shù)組和XNJ組( P＜0.05)。

表1　缺血再灌注后24 h、48 h和72 h各組大鼠腦組織中含水量的變化Table 1.The change of water content 24 h，48 h and 72 h after ischemia-reperfusion in brain tissue of rats( %.Mean ±SEM.n =6)

2 EB染色及EB含量測定

EB在正常情況下與血漿白蛋白結(jié)合不能著色;當(dāng)腦缺血再灌注損傷后由于BBB破壞，通透性增加，EB會通過血管壁進(jìn)入腦組織而著色，因此EB可作為示蹤劑對BBB破壞進(jìn)行定量評價。實驗結(jié)果顯示模型組、溶劑對照組和XNJ組均有EB的滲漏，說明均有血腦屏障的破壞。在缺血再灌注后24 h，模型組、溶劑對照組和XNJ組大鼠腦組織內(nèi)EB含量均顯著高于假手術(shù)組( P＜0.05)。缺血再灌注后48 h和72 h，模型組和溶劑對照組的腦組織內(nèi)EB含量顯著高于假手術(shù)組和XNJ組( P＜0.05)，且XNJ組又顯著高于假手術(shù)組( P＜0.05)，見圖1。

Figure 1.Change of EB 24 h，48 h and 72 h after ischemiareperfusion in brain tissue of rats.Mean±SEM.n = 6.*P＜0. 05 vs sham group;#P＜0.05 vs model group.圖1　缺血再灌注后24 h、48 h和72 h各組大鼠腦組織中EB含量的變化

3 缺血再灌注后24 h、48 h和72 h各組大鼠皮層中ZO-1的表達(dá)情況

缺血再灌注后24 h，模型組、溶劑對照組和XNJ組大鼠腦皮層中的ZO-1蛋白表達(dá)水平顯著低于假手術(shù)組( P＜0.05)。缺血再灌注后48 h和72 h，模型組和溶劑對照組皮層中的ZO-1蛋白表達(dá)水平仍比較低，但XNJ組的ZO-1蛋白表達(dá)逐漸升高。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)比較，缺血再灌注后48 h和72 h，模型組和溶劑對照組皮層中的ZO-1蛋白表達(dá)水平顯著低于假手術(shù)組和XNJ組( P＜0.05)，但XNJ組又顯著低于假手術(shù)組( P＜0.05)，見圖2。

Figure 2.Change of ZO-1 24 h，48 h and 72 h after ischemiareperfusion in brain cortex of rats.Mean±SEM.n = 6.*P＜0. 05 vs sham group;#P＜0.05 vs model group.圖2　缺血再灌注后24 h、48 h和72 h各組大鼠腦皮層中ZO-1蛋白表達(dá)的變化

討論

血腦屏障［8］是主要由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞( brain microvascular endothelial cell，BMEC)、細(xì)胞間緊密連接( tight junction，TJ)、連續(xù)的基底膜和基底外側(cè)的星形膠質(zhì)細(xì)胞終足等結(jié)構(gòu)構(gòu)成，并保持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定。腦缺血再灌注可導(dǎo)致血腦屏障破壞，通透性增加，炎性因子及有害物質(zhì)進(jìn)入腦組織，引起腦水腫形成，從而加重腦損傷。腦缺血發(fā)生的時候，伊文思藍(lán)出現(xiàn)在缺血區(qū)，表明BBB通透性增加;腦組織相對含水量可用于估計大鼠腦水腫的程度。張紅波等［9］通過腹腔注射醒腦靜小劑量組( 3. 33 mL/kg)、中劑量組( 6.66 mL/kg)、大劑量組( 10 mL/kg)初步觀察發(fā)現(xiàn)，醒腦靜注射液對腦組織的保護(hù)作用存在較明顯的量效關(guān)系。本實驗采用腹腔注射醒腦靜注射液10 mL·kg-1·d-1，結(jié)果顯示:大鼠全腦缺血再灌注后24 h，模型組、溶劑對照組和XNJ組的腦組織含水量均顯著高于假手術(shù)組，但在缺血再灌注后48 h和72 h，模型組和溶劑對照組的腦組織含水量顯著高于XNJ組和假手術(shù)組。缺血再灌注后24 h，模型組、溶劑對照組和XNJ組大鼠腦組織內(nèi)伊文思藍(lán)( EB)含量均高于假手術(shù)組，缺血再灌注后48 h和72 h，假手術(shù)組和XNJ組的EB含量顯著低于模型組和溶劑對照組。提示全腦缺血再灌后出現(xiàn)腦水腫和血腦屏障的通透性增加，醒腦靜有穩(wěn)定血腦屏障通透性、減輕腦水腫的作用。

血腦屏障的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)一般有2種途徑:跨細(xì)胞途徑和細(xì)胞旁途徑。細(xì)胞間緊密連接是BBB最主要的物質(zhì)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，它能夠封閉內(nèi)皮細(xì)胞頂部的細(xì)胞間隙，阻止細(xì)胞外的大分子物質(zhì)經(jīng)細(xì)胞間隙進(jìn)入組織內(nèi)，是細(xì)胞間的通透屏障，通過細(xì)胞旁路徑調(diào)控水、離子和大分子物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。血腦屏障細(xì)胞旁途徑是主要通過調(diào)節(jié)ZO-1、occludin和claudin-5等緊密連接相關(guān)蛋白和黏附連接蛋白等結(jié)構(gòu)，開放緊密連接，增加血腦屏障的通透性［10］。Preston等［11］通過計算BBB對大分子示蹤劑和水分子示蹤劑通透性的轉(zhuǎn)運(yùn)常數(shù)發(fā)現(xiàn)，大鼠短暫性腦缺血再灌注后BBB通透性的增加主要是由TJ開放導(dǎo)致，而并非是胞飲轉(zhuǎn)運(yùn)增強(qiáng)。ZO-1是緊密連接的重要結(jié)構(gòu)蛋白，不僅表達(dá)于緊密連接，也表達(dá)于黏附連接，對緊密連接的形成和定位都有重要作用，研究表明ZO-1的缺失會導(dǎo)致緊密連接結(jié)構(gòu)的破壞，其水平的高低與BBB的開放、關(guān)閉關(guān)系密切［8］，實驗通過Western blot檢測ZO-1蛋白的表達(dá)顯示，缺血再灌注后24 h，模型組、溶劑對照組和XNJ組大鼠腦皮層中的ZO-1蛋白表達(dá)水平顯著低于假手術(shù)組，同樣缺血再灌注后48 h和72 h，假手術(shù)組和XNJ組皮層中的ZO-1蛋白含量顯著高于模型組和溶劑對照組。提示全腦缺血再灌后ZO-1蛋白表達(dá)水平下降，醒腦靜能使表達(dá)降低的ZO-1蛋白顯著上調(diào)，起到了保護(hù)BBB的作用，這可能是醒腦靜注射液發(fā)揮對腦缺血再灌注后BBB保護(hù)作用的機(jī)制之一。醒腦靜射液對其它緊密連接相關(guān)蛋白是否有影響待進(jìn)一步研究。

醒腦靜注射液是臨床常用的中成藥急救藥品，該藥具有醒腦開竅、清熱涼血、行氣活血和解熱止痛等功效［12］，靜脈給藥后可通過血腦屏障直接作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，具有興奮中樞、解熱、鎮(zhèn)痛、抑菌、抗炎、保肝的藥效。本實驗表明，醒腦靜能上調(diào)ZO-1蛋白的表達(dá)，穩(wěn)定血腦屏障通透性，減輕腦水腫。

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Effects of Xingnaojing injection on expression of ZO-1 in blood-brain barrier after global ischemia-reperfusion

ZHONG Zhi-yue，LI Bing，LIU Ming，LI Hong-zhi，LIANG Xiao-jun，SHEN Jie
( Intensive Care Unit，Chemical Injury Treatment Center，Jinshan Hospital，F(xiàn)udan University，Shanghai 201508，China.E-mail: j1999sh@163.com)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the effect of Xingnaojing ( XNJ) injection on the permeability of blood-brain barrier ( BBB) and zonula occludens-1 ( ZO-1) protein expression after global ischemia-reperfusion in rats.METHODS: Improved Pulsinelli four-vessel occlusion method was adopted to establish the global ischemia-reperfusion model in the rats.Male Wistar rats were randomly divided into sham group，model group，solvent group and XNJ group.The observations were conducted at the time points of 24 h，48 h and 72 h after ischemia reperfusion.The water content of the brain tissues was determined by dry-wet weight method，while the Evans blue ( EB) content of brain tissue was detected by spectrophotometry.The protein levels of ZO-1 in the cerebral cortex were analyzed by Western blot.RESULTS: The water contents in the brain tissues in model group，solvent group and XNJ group were significantly higher than those in sham group ( P＜0.05) 24 h after ischemia reperfusion.However，the brain water contents in model group and solvent group were significantly higher than those in XNJ group and sham group ( P＜0.05) 48 h and 72 h after ischemia reperfusion.The EB contents in the brain tissues in model group，solvent group and XNJ group were entirely higher than that in sham group 24 h after ischemia reperfusion ( P＜0.05).The EB contents in sham group and XNJ group were significantly lower than those in model group and solvent group 48 h and 72 h after ischemia reperfusion ( P＜0.05).The protein expression of ZO-1 in the rat cerebral cortex in model group，solvent group and XNJ group was significantly lower than that in sham group 24 h after ischemia-reperfusion ( P＜0.05).Similarly，48 h and 72 h after ischemia reperfusion，ZO-1 protein level in the cortex in sham group and XNJ group was significantly higher than that in model group and solvent group ( P＜0.05).CONCLU-book=1321,ebook=177SION: At 48 h and 72 h after global ischemia-reperfusion，Xingnaojing injection play a protective role in blood-brain barrier and this role may be associated with the increase in ZO-1 protein expression by Xingnaojing injection.

［KEY WORDS］Xingnaojing injection; Ischemia-reperfusion; Blood-brain barrier; Zonula occludens-1 protein

通訊作者△Tel: 021-34189990; E-mail: j1999sh@163.com

*［基金項目］上海市衛(wèi)生局中醫(yī)藥科研基金資助項目( No.2012J018B)

［收稿日期］2014-10-14［修回日期］2015-04-24

［文章編號］1000-4718( 2015)07-1320-04

［中圖分類號］R363. 2

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.07.030