時冉冉，李伯和，袁　磊，付陳增，陳　嬌，王建國(漯河醫(yī)學高等?？茖W校分子生物學實驗室，河南漯河　462002)

腫瘤抗原PIWIL2的HLA-A2限制性CTL表位鑒定*

時冉冉，李伯和，袁磊，付陳增，陳嬌，王建國△
(漯河醫(yī)學高等專科學校分子生物學實驗室，河南漯河462002)

［摘要］目的:鑒定腫瘤抗原PIWIL2的人類白細胞抗原A2( HLA-A2)限制性細胞毒性T淋巴細胞( CTL)表位。方法:首先運用RT-PCR、Western blot方法檢測PIWIL2在腫瘤細胞系MCF-7、SW480和HT-29中的表達情況，然后通過BIMAS、RankPep、NetMHC、NetCTL1. 2及IEDB軟件預測打分來選取PIWIL2的HLA-A2限制性的表位。候選表位肽通過標準的Fmoc化學合成法合成，結合力實驗用于檢測候選表位與T2A2細胞表面HLA-A2分子的結合能力，ELISPOT實驗檢測候選表位肽誘導CTL分泌IFN-γ的能力，體外細胞毒性實驗檢測候選肽誘導CTL的能力。結果: PIWIL2在腫瘤細胞系MCF-7、SW480和HT-29中均有表達。候選肽P485、P493、P965具有中等結合力。ELISPOT實驗結果顯示表位肽P485和P965誘導的CTL具有分泌IFN-γ的能力。細胞毒性實驗結果顯示表位肽P485和P965對MCF-7細胞均有一定的殺傷作用。結論:表位肽P485和P965是優(yōu)秀的PIWIL2抗原HLAA2限制性CTL候選表位，可能成為新的抗腫瘤多肽免疫治療疫苗的候選表位。

［關鍵詞］PIWIL2;人類白細胞抗原A2;細胞毒性T淋巴細胞

腫瘤的免疫治療被認為是治療腫瘤患者的一種理想選擇，在所有免疫治療的方法中，腫瘤特異性抗原表位誘導的細胞毒性T淋巴細胞( cytotoxic T lymphocyte，CTL)能夠殺死表達抗原的腫瘤細胞［1］。誘發(fā)體內(nèi)細胞毒性T淋巴細胞發(fā)揮抗腫瘤作用的并不是整個腫瘤抗原分子，而是與主要組織相容性復合物( major histocompability complex，MHC)分子結合的短肽即CTL表位，因此，尋找特異性腫瘤抗原及其相應的CTL表位成為腫瘤治療的關鍵。在過去的20年里，腫瘤免疫治療有著很大的進展，鑒定了許多腫瘤抗原的表位［2-3］。目前已經(jīng)有多種抗原肽疫苗進入了臨床試驗，對來自于HER-2/neu、MAGE-A3、MART-1、TRP-2、gp100和NY-ESO-1等抗原的單個或混合表位肽疫苗均有較多的研究［4］。除此之外，bcr-abl多肽疫苗已開始Ⅱ期臨床試驗。對引發(fā)bcrabl肽特異CTL的多肽報道有17肽、16肽、12肽和9肽等多肽。肽作為腫瘤疫苗進行臨床試驗，研究較多的是惡性黑色素瘤?？偟膩碇v，在轉移性黑色素瘤患者中，有效率約在10%～30%之間，沒有嚴重的不良反應發(fā)生。不同種類的腫瘤抗原CTL表位的鑒定推動了腫瘤治療性疫苗的發(fā)展［5］。研究發(fā)現(xiàn)很多癌前干細胞表達PIWIL2，它屬于癌睪抗原家族，PIWIL2廣泛地表達于各種人類和小鼠腫瘤細胞中，在正常組織中僅存在于睪丸組織中，且特異性表達在生殖細胞的精原細胞和精母細胞期，PIWIL2直接參與了精細胞的形成和精母細胞的分化［6］。在中國的人群中，HLA-A2超型超過50%［7］，所以鑒定PIWIL2 的HLA-A2限制性CTL表位對腫瘤的免疫治療意義重大［8］。

材料和方法

1材料

T2A2細胞系、MCF-7( HLA-A2+)、SW480( HLAA2+)以及HT-29( HLA-A2-)由漯河醫(yī)學高等?？茖W校分子醫(yī)學實驗室常規(guī)保存，采用37℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)條件下常規(guī)培養(yǎng)。外周血單個核細胞( peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)由HLAA2+健康供者捐贈。

2方法

2.1PIWIL2在腫瘤細胞中的表達采用RT-PCR、Western blot法檢測PIWIL2在腫瘤細胞MCF-7、SW480和HT-29的表達情況。PIWIL2的上游引物序列為5’-CCCAGGTTGTCAATGTTCG-3’，下游引物序列為5’-CAGGCTGTCCACAATCTCC-3’，產(chǎn)物大小278 bp，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

2.2HLA-A2限制性CTL表位肽的預測結合BIMAS、RankPep、NetMHC、NetCTL1. 2及IEDB軟件對PIWIL2氨基酸序列的預測打分。本次研究以A2超型為主，參數(shù)設定為CTL表位限制性MHC類型( HLA-A*0201)，預測抗原肽長度。根據(jù)各個預測軟件所推選的前30個優(yōu)勢表位進行綜合選擇，選出在各種軟件打分較好的HLA-A2限制性表位。

2.3HLA-A2限制性CTL表位肽的合成、純化、分析及質譜鑒定候選表位肽采用標準Fmoc方法合成，經(jīng)HPLC分析純化后，其純度大于95%，質譜分析其相對分子質量符合理論值。

2.4表位肽與HLA-A2分子的結合力檢測收集T2A2細胞，用無血清1640培養(yǎng)基洗3次，調(diào)整細胞濃度至1×109/L，每孔1 mL，每實驗孔加入待測肽50 mg/L，β2微球蛋白(β2-microglobulin，β2-M) 2. 5 mg/L，37℃、5% CO2共孵育18 h后，冷PBS洗滌3次，加入500 μL稀釋度為1∶100的單克隆抗體BB7. 2，4℃避光靜置30 min。之后冷PBS洗滌3次，加入50 μL稀釋度為1∶50的FITC-羊抗鼠溶液，4℃靜置40 min，PBS洗滌1次后上流式細胞儀檢測。其結果用熒光系數(shù)表示:熒光系數(shù)( FI) (表位肽平均熒光強度－背景平均熒光強度) /背景平均熒光強度。FI＞1. 0表示高等結合力，1. 0＞FI＞0. 5表示中等結合力，F(xiàn)I＜0. 5表示低結合力［9］。

2.5CTL的體外誘導抽取HLA-A2+健康供者的外周血，經(jīng)常規(guī)聚蔗糖-泛影葡胺分層液梯度離心，獲取PBMCs，用含10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為1. 5×109/L。第2天分別加入10 mg/L的候選肽共培養(yǎng)，第3天加入5×104U/L的rIL-2繼續(xù)培養(yǎng)。每周收集細胞，1 000 r/min離心10 min，除去上清，加入新鮮的10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基，同時加入上述條件的候選肽和rIL-2。刺激3輪后于最后一次刺激的第3天收集細胞。調(diào)整細胞濃度作為效應細胞。用無血清IMDM培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度作為靶細胞［10］。

2.6IFN-γ分泌水平檢測取出ELISPOT板條，加200 μL無血清的IMDM培養(yǎng)基進行封閉，靜置10 min;誘導的CTL作為效應細胞，荷肽的T2A2作為刺激細胞，細胞濃度均調(diào)整為2×109/L;設立對照孔、實驗孔; 37℃、5% CO2孵育18 h;棄孔中培養(yǎng)基，每孔加入200 μL無菌的去離子水，4℃裂解細胞10 min;棄孔內(nèi)液體，加入200 μL washing buffer進行洗滌，洗滌6次，每次停留60 s;加入100 μL生物素標記的抗體，37℃孵育1 h;棄孔內(nèi)液體，加入200 μL washing buffer進行洗滌，洗滌方法同上，在吸水紙上拍干;加入100 μL酶聯(lián)親和素，37℃孵育1 h;每孔加入200 μL washing buffer進行洗滌，洗滌方法同上;加入100 μL現(xiàn)配的AEC顯色液，25℃避光靜置30 min;結束后置于通風處，室溫靜置干燥;結果用ELISPOT圖像分析儀計數(shù)96孔板中每孔的斑點數(shù)［11］。

2.7細胞毒活性檢測調(diào)整CTL細胞濃度為5× 109/L;調(diào)整靶細胞MCF-7細胞濃度為1×108/L;按50∶1、25∶1和12. 5∶1的不同效靶比鋪于96孔板中，同時設立效應細胞自發(fā)釋放組、靶細胞自發(fā)釋放組、靶細胞最大釋放組、體積校正組和背景對照組，每孔終體積為100 μL。37℃、5% CO2培養(yǎng)4 h。于孵育結束前45 min，在靶細胞最大釋放組及體積校正組中加入10 μL裂解液。1 000 r/min離心4 min，轉移50 μL上清至另一干凈96孔板中，每孔加入50 μL底物混合液，室溫避光孵育30 min;再加入50 μL/孔終止液。用酶標儀檢測其在490 nm波長處的吸光度值。殺傷率= (實驗孔值－效應細胞自發(fā)釋放值－CTL自發(fā)釋放值) /(靶細胞值－效應細胞自發(fā)釋放值)×100%［12］。

3統(tǒng)計學處理

用Graphpad Prism 5. 0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差( mean±SD )表示。2組間采用單因素方差分析( one-way ANOVA)，以P＜0. 05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1 PIWIL2在腫瘤細胞系中的表達

分別使用RT-PCR以及Western blot的方法檢測PIWIL2在腫瘤細胞系中的表達。從圖1中可以看出，PIWIL2 mRNA及蛋白在MCF-7、SW480和HT-29 這3種腫瘤細胞系中均有表達。

Figure 1.Expression of PIWIL2 mRNA( A) and protein( B) in cancer cell lines.圖1　腫瘤細胞系中PIWIL2的表達

2 PIWIL2 HLA-A2限制性CTL表位的預測結果

依據(jù)BIMAS、RankPep、NetMHC、NetCTL1. 2及IEDB共5個預測軟件的結果，選取在各個預測軟件中分值排名靠前的表位肽，根據(jù)這5個預測軟件進行綜合打分，篩選出分值在各個軟件中打分較好的CTL表位肽，共8條，見表1。

3表位肽/HLA-A2分子結合力的實驗結果

使用流式細胞術進行檢測，對所得到的數(shù)據(jù)進行處理，結果表明P376、P555、P756和P767具有弱結合力( FI＜0. 5) ; P485、P493和P965具有中等結合力( FI＞0. 5)，見表1。

表1　PIWIL2 HLA-A2限制性CTL表位預測和結合力實驗結果Table 1.Prediction scores of the peptide derived from PIWIL2 and the data of the binding affinity

4 IFN-γ分泌的水平

從健康供者外周血中分離得到PBMCs，體外用多肽作為刺激物對PBMCs進行刺激，經(jīng)過一系列處理，并且體外培養(yǎng)11 d后，用ELISPOT法通過特異性抗體對刺激后的PBMCs所分泌的IFN-γ進行檢測。以空載T2A2和荷肽T2A2作為靶細胞，通過計數(shù)板中的細胞斑點數(shù)目，來檢測分泌IFN-γ CTL的細胞數(shù)，以此來判斷多肽誘導的特異性CTL分泌IFN-γ的能力。根據(jù)結合力的實驗結果，我們選擇了3條具有中等結合力的多肽進行實驗，即P485、P493 和P965。結果顯示P485和P965多肽疫苗能檢測到特異性T細胞免疫，能分泌較多的IFN-γ，見圖2。

Figure 2.IFN-γ release was measured by ELISPOT assay in CTLs induced PBMCs of healthy donors.CTL-induced by PBS and irrelevant peptide HBcAg 18～27 were taken as negative control.Means±SD.n = 3.＊＊P＜0. 05 vs HBcAg 18-27.圖2　ELISPOT法PIWIL2候選表位肽特異性CTL分泌IFN-γ的能力

5 細胞毒實驗結果

根據(jù)IFN-γ分泌水平結果，我們將有效果的P485、P965行進一步的免疫活性檢測，P485、P965兩條候選肽誘導得到的CTL在不同效靶比( 12. 5∶1，25∶1，50∶1)時對PIWIL2表達陽性的乳腺癌細胞MCF-7( HLA-A2+)的殺傷情況。P485、P965兩條候選肽誘導得到的CTL在效靶比為50∶1時對靶細胞的殺傷率分別是( 37. 5±3. 3) %和( 32. 9±3. 6) %，而對照組PBS和無關肽組HBcAg 18-27在效靶比為50∶1時對靶細胞的殺傷率分別為( 2. 8±1. 8) %和( 2. 2±1. 3) %。

Figure 3.The cytotoxic effects of the CTLs induced by P485 and P965 on the MCF-7 ( HLA-A2+) cells.Means±SD.n =3.＊＊P＜0. 01 vs HBcAg 18-27 group.圖3 P485、P965候選肽誘導得到的CTL在不同效靶比時對靶細胞MCF-7的殺傷情況

討論

腫瘤的免疫治療目的是以提高病人自身的免疫力，誘發(fā)機體自身抗腫瘤免疫反應，殺傷或抑制腫瘤細胞，在腫瘤的預防與治療當中發(fā)揮了重要的作用，制備高效的腫瘤疫苗已成為早期診斷和免疫治療的熱點［13-14］。利用細胞免疫治療癌癥中，T細胞表位發(fā)揮了重要的角色。許多臨床試驗已經(jīng)獲得了比較有前景的實驗結果［8-10］。關于腫瘤診斷用的腫瘤標記分子近年來已有許多報道。細胞介導腫瘤免疫治療的效果取決于免疫刺激的策略和有潛力的腫瘤抗原T細胞表位的篩選［1］。T細胞表位的鑒定不僅僅用于新疫苗的發(fā)展，也有助于理解腫瘤抗原的提呈方式［15-16］。然而，仍然有很多問題需要解決，例如表位低免疫原性和體內(nèi)快速的蛋白降解。這些可以用化學改造的方式來提高其免疫原性和穩(wěn)定性［17］。在蛋白疫苗的基礎上，通過對腫瘤抗原編碼基因的序列分析，分析其被CD8+識別的抗原表位，構建多肽疫苗，能夠加強HLA和TCR的結合，而且還可以通過氨基酸替換、改變肽的構象以及修飾氨基酸殘基等方法提高肽的免疫原性［18］。

有很多生物信息學的方法可進行T細胞表位的預測。在本次研究中，我們選擇了5個預測軟件BIMAS、RankPep、NetMHC、NetCTL1. 2及IEDB，綜合這些預測軟件的打分結果進行初步的表位預測篩選，BIMAS的預測側重于表位肽與HLA分子結合的穩(wěn)定性方面，IEDB是基于序列的線性表位預測工具，NetCTL1. 2綜合了表位肽與HLA分子的結合力、蛋白酶體降解以及TAP呈遞效率這些方面來預測表位。這些軟件主要從MHC分子與表位肽的結合進行預測，從而篩選出親和力較高的表位肽。使用生物信息學軟件的初步篩選，排除打分較低的候選表位，避免不必要的實驗，減輕了工作量，提高了科研效率。根據(jù)結合力實驗結果篩選出3條具有中等結合力的表位肽，即P485、P493、P965。隨后對這3條肽進行體外免疫活性檢測，通過ELISPOT實驗，我們可以檢測出抗原特異性CTL的數(shù)量及IFN-γ的分泌量。結果顯示P485、P965多肽疫苗能檢測到特異性T細胞免疫，能分泌較多的IFN-γ。并且通過細胞毒性實驗表明，這2條肽對靶細胞MCF-7具有殺傷作用。說明表位肽誘導的CTL對靶細胞MCF-7有殺傷作用。鑒定的優(yōu)勢表位為腫瘤的多表位疫苗設計和免疫治療提供了新的候選表位，并且也有多表位疫苗在過繼性免疫治療和臨床應用提供了支持［19］。

［參考文獻］

［1］Kessler JH，Melief CJ.Identification of T-cell epitopes for cancer immunotherapy［J］.Leukemia，2007，21 ( 9) : 1859-1874.

［2］Rosenberg SA，Restifo NP，Yang JC，et al.Adoptive cell transfer: a clinical path to effective cancer immunotherapy ［J］.Nat Rev Cancer，2008，8( 4) : 299-308.

［3］Blattman JN，Greenberg PD.Cancer immunotherapy: a treatment for the masses［J］.Science，2004，305 ( 5681) : 200-205.

［4］Amadori D，Milandri C，Comella G，et al.A phase I/II trial of non-pegylated liposomal doxorubicin，docetaxel and trastuzumab as first-line treatment in HER-2-positive locally advanced or metastatic breast cancer［J］.Eur J Cancer，2011，47( 14) : 2091-2098.

［5］Bredenbeck A，Losch FO，Sharav T，et al.Identification of noncanonical melanoma-associated T cell epitopes for cancer immunotherapy［J］.J Immunol，2005，174( 11) : 6716-6724.

［6］Seto AG，Kingston RE，Lau NC.The coming of age for Piwi proteins［J］.Mol Cell，2007，26( 5) : 603-609.

［7］Xue F，Wang J，Hu P，et al.Identification of spatial genetic boundaries using a multifractal model in human population genetics［J］.Hum Biol，2005，77( 5) : 577-617.

［8］Uenaka A，Hirano Y，Hata H，et al.Cryptic CTL epitope on a murine sarcoma Meth A generated by exon extension as a novel mechanism［J］.J Immunol，2003，170( 9) : 4862-4868.

［9］Zhu YH，Gao YF，Chen F，et al.Identification of novel T cell epitopes from efflux pumps of Mycobacterium tuberculosis［J］.Immunol Lett，2011，140( 1-2) : 68-73.

［10］Wu ZY，Gao YF，Wu YH，et al.Identification of a novel CD8+T cell epitope derived from cancer-testis antigen MAGE-4 in oesophageal carcinoma［J］.Scand J Immunol，2011，74( 6) : 561-567.

［11］Liu W，Zhai M，Wu Z，et al.Identification of a novel HLA-A2-restricted cytotoxic T lymphocyte epitope from cancer-testis antigen PLAC1 in breast cancer［J］.Amino Acids，2012，42( 6) : 2257-2265.

［12］Zhu B，Chen Z，Cheng X，et al.Identification of HLAA*0201-restricted cytotoxic T lymphocyte epitope from TRAG-3 antigen［J］.Clin Cancer Res，2003，9 ( 5) : 1850-1857.

［13］袁磊，陳旭東，范文娟，等.沉默Notch1基因促進人乳腺癌MCF-7細胞JNK1和p53磷酸化［J］.中國病理生理雜志，2013，29( 6) : 1014-1019.

［14］袁磊，左曙光，范文娟，等.IGFBP7對人乳腺癌MCF-7細胞增殖的影響及其機制［J］.中國病理生理雜志，2012，28( 10) : 1835-1840.

［15］Goonetilleke N，Moore S，Dally L，et al.Induction of multifunctional human immunodeficiency virus type 1 ( HIV-1 ) -specific T cells capable of proliferation in healthy subjects by using a prime-boost regimen of DNA-and modified vaccinia virus Ankara-vectored vaccines expressing HIV-1 Gag coupled to CD8+T-cell epitopes［J］.J Virol，2006，80( 10) : 4717-4728.

［16］Salmon-Ceron D，Durier C，Desaint C，et al.Immunogenicity and safety of an HIV-1 lipopeptide vaccine in healthy adults: a phase 2 placebo-controlled ANRS trial ［J］.AIDS，2010，24( 14) : 2211-2223.

［17］Shi RR，Liu J，Zou Z，et al.The immunogenicity of a novel cytotoxic T lymphocyte epitope from tumor antigen PL2L60 could be enhanced by 4-chlorophenylalanine substitution at position 1［J］.Cancer Immunol Immunother，2013，62( 11) : 1723-1732.

［18］彭松，貝俊杰，胡厚源，等.融合蛋白TAP-SSLS對激活的血小板與人淋巴細胞結合的影響［J］.中國病理生理雜志，2015，31( 1) : 23-27.

［19］Wu YH，Gao YF，He YJ，et al.A novel cytotoxic T lymphocyte epitope analogue with enhanced activity derived from cyclooxygenase-2［J］.Scand J Immunol，2012，76 ( 3) : 278-285.

Identification of HLA-A2 restricted cytotoxic T lymphocyte epitopes from tumor antigen PIWIL2

SHI Ran-ran，LI Bo-he，YUAN Lei，F(xiàn)U Chen-zeng，CHEN Jiao，WANG Jian-guo
( Laboratory of Molecular Biology，Luohe Medical College，Luohe 462002，China.E-mail: ranranpeptide@163.com)

［ABSTRACT］AIM: To identify the human leucocyte antigen A2 ( HLA-A2) restricted cytotoxic T lymphocyte ( CTL) epitopes from tumor antigen PIWIL2.METHODS: RT-PCR and Western blot was used to determine the expression of PIWIL2 in cancer cell lines MCF-7，SW480 and HT-29.HLA-A2 epitopes from PIWIL2 protein were predicted by the software of BIMAS，RankPep，NetMHC，NetCTL1. 2 and IEDB.The peptides were synthesized by standard solid-phase methods.The binding affinity of the peptides to HLA-A2 molecules was evaluated by T2 cells binding assay.ELISPOT assay was used to investigate the levels of IFN-γ.The cytotoxicity assay in vitro was also used to determine the ability of inducing T cell response by the peptides.RESULTS: The expression of PIWIL2 was observed in MCF-7，SW480 and HT-29.The candidate peptide P485，P493 and P965 showed moderate affinity toward HLA-A2 molecule.ELISPOT assay showed P485 and P965 induced CTLs of IFN-γ release form CTLs.The CTLs induced by P485 and P965 lysed the MCF-7 cells.CONCLUSION: The peptides P485 and P965 are excellent HLA-A2 restricted cytotoxic T lymphocyte epitopes from the tumor antigen PIWIL2，which could serve as new candidates towards antitumor peptide vaccines.

［KEY WORDS］PIWIL2; Human leucocyte antigen A2; Cytotoxic T lymphocytes

通訊作者△Tel: 0395-2112681; E-mail: ranranpeptide@163.com

*［基金項目］河南省科技發(fā)展計劃資助項目( No.142102310466) ;漯河醫(yī)學高等專科學?？蒲谢鹳Y助項目( No.2014-SLMC09)

［收稿日期］2014-11-27［修回日期］2015-02-02

［文章編號］1000-4718( 2015)07-1315-05

［中圖分類號］Q279

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.07.029