應(yīng) 俊， 潘若望， 王茂峰， 陳吉順， 劉 倩， 張洪勤， 包其郁， 李佩珍△

(1溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江溫州325035;2中國人民解放軍第118醫(yī)院，浙江溫州325000;3溫州醫(yī)科大學(xué)附屬東陽醫(yī)院，浙江東陽322103)

喉癌是頭頸部常見的惡性腫瘤之一，占全身惡性腫瘤的5.7% ～7.6%，占耳鼻喉科惡性腫瘤的7.9%～35.0%，環(huán)境污染的增加和不良生活習(xí)慣使我國各地的喉癌發(fā)病率呈上升趨勢［1］。對喉癌的治療目前主要還是手術(shù)、放療、化療，但對于中晚期喉癌患者，預(yù)后仍不夠理想且副作用太大。歐洲癌癥研究與治療組織(EORTC)頭頸合作組進行了以順鉑和氟尿嘧啶為主的誘導(dǎo)化療方案，結(jié)果表明在沒有影響總生存率的前提下，患者的喉保留率54.0%，遠處轉(zhuǎn)移率明顯降低［2］。但由于化療藥物副作用大，無法大劑量的使用，從而限制了腫瘤的治療手段。因此，發(fā)現(xiàn)并篩選新的高效低毒的化療藥物己成為當(dāng)今腫瘤治療研究的重點。

藻藍蛋白(phycocyanin，PC)是一種普遍存在于藍藻和螺旋藻細胞內(nèi)的捕光色素蛋白，具有抗腫瘤、抗氧化、抗突變、抗病毒等多種生物學(xué)功能，有重要的開發(fā)利用價值［3］?，F(xiàn)今研究已發(fā)現(xiàn)，無論是光動力學(xué)方向還是體內(nèi)外直接作用于腫瘤細胞株，藻藍蛋白在抗腫瘤方面都有著極佳的前景。但目前有關(guān)藻藍蛋白抗腫瘤免疫活性作用的分子作用機制尚未明確，關(guān)于藻藍蛋白和喉癌的關(guān)系至今沒有比較系統(tǒng)的文獻報道。為此本課題選用人喉癌HEP-2細胞進行實驗，通過MTT法觀察藻藍蛋白對人喉癌HEP-2細胞活力的影響，采用普通倒置顯微鏡、電鏡、流式細胞術(shù)觀察藻藍蛋白對HEP-2細胞凋亡的影響，利用RT-PCR、Western blot等進一步從細胞分子水平深入探討藻藍蛋白的抗腫瘤作用機制，為今后應(yīng)用藻藍蛋白治療惡性腫瘤奠定一定基礎(chǔ)。

材料和方法

1 細胞和主要試劑

人喉癌HEP-2細胞購于中科院上海細胞庫。藻藍蛋白純度(A620/A280)達4.24，由本實驗室從新鮮鈍頂螺旋藻中提取純化制得。1640培養(yǎng)基、胰酶為Gibco產(chǎn)品;胎牛血清為杭州四季青生物科技有限公司生產(chǎn);MTT和二甲基亞砜(DMSO)為Sigma產(chǎn)品;Annexin V/PI染色試劑盒為聯(lián)科生物產(chǎn)品;RT-PCR及PCR相關(guān)試劑為TaKaRa產(chǎn)品;N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)、活性氧(reactive oxygen species，ROS)檢測試劑盒、caspase-3、-8、-9 活性檢測試劑盒、RIPA細胞裂解液、PMSF、鼠單克隆抗體cleaved caspase-3、鼠單克隆抗體P53、鼠單克隆抗體β-actin、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG抗體及ECL發(fā)光試劑盒均為上海碧云天公司產(chǎn)品。

2 主要方法

2.1 細胞培養(yǎng) 人喉癌HEP-2細胞株在含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的1640培養(yǎng)液中生長，并置于37℃、5%CO2的相對飽和濕度孵箱中培養(yǎng)，細胞呈貼壁生長，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

2.2 MTT法檢測藻藍蛋白對HEP-2細胞生長的影響 取對數(shù)生長期的HEP-2細胞，胰酶消化，細胞計數(shù)板計數(shù)并調(diào)整細胞懸液濃度達到1.0×108/L，每孔加入100 μL細胞懸液于96孔細胞培養(yǎng)板中，37℃、5%CO2過夜培養(yǎng)至細胞完全貼壁。加入不同濃度的藻藍蛋白培養(yǎng)液(終濃度為 10、20、40、80、160、320 mg/L)，每個濃度做5個復(fù)孔，并設(shè)順鉑陽性對照和不含藻藍蛋白的陰性對照。分別以不同的時間梯度進行培養(yǎng)后，加入MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h，棄上清，加入DMSO 150 μL，避光振蕩10 min。用酶標(biāo)儀于490 nm處測各孔吸光度值(A)。統(tǒng)計數(shù)據(jù)后計算各不同濃度藥物對細胞抑制率(R)和半效抑制濃度(IC50)。R=［(對照組A值－實驗組A值)/對照組A值］×100%。

2.3 倒置顯微鏡下觀察藻藍蛋白對HEP-2細胞形態(tài)的影響 生長狀況較好的HEP-2細胞消化制備細胞懸液，濃度達到1.0×108/L，接種1.5 mL細胞懸液于裝有蓋玻片的6孔板中。待細胞貼壁后，加入藻藍蛋白(0、20、40、80、160、320 mg/L)分別干預(yù)人HEP-2細胞24 h和48 h，倒置顯微鏡下觀察HEP-2細胞形態(tài)變化并拍照。

2.4 掃描電子顯微鏡觀察細胞的表面結(jié)構(gòu) 在6孔板中分別放入已處理的蓋玻片，每孔加入濃度為1.0×108/L的細胞懸液1.5 mL。培養(yǎng)24 h后根據(jù)實驗分組加藥處理，藻藍蛋白終濃度分別為 0、80、160、320 mg/L。處理48 h后將細胞爬片放入4%戊二醛固定液中4℃固定過夜，次日取出經(jīng) PBS緩沖液清洗3次，自然晾干，1%鋨酸固定，乙醇梯度脫水，叔丁醇梯度置換，真空干燥，離子濺射鍍膜，放于掃描電鏡中觀察細胞表面結(jié)構(gòu)的變化并拍照保存［4］。

2.5 透射電子顯微鏡觀察細胞的超微結(jié)構(gòu) 收集經(jīng)0、80、160、320 mg/L藻藍蛋白作用 48 h的HEP-2細胞及未經(jīng)處理的 HEP-2細胞，1 500 r/min 4℃離心5 min，PBS洗2次。沉淀經(jīng)2.5%戊二醛前固定，1%鋨酸后固定，丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，醋酸鉛-鈾雙重染色，透射電子顯微鏡下觀察細胞的超微結(jié)構(gòu)并拍照［5］。

2.6 流式細胞術(shù)檢測藻藍蛋白對HEP-2細胞凋亡的影響 不同濃度藻藍蛋白(0、20、40、80、160、320 mg/L)處理HEP-2細胞48 h后，1 000 r/min離心5 min，去上清，用 400 μL PBS 重懸洗滌 2 次，Annexin V-FITC/PI雙熒光(FITC 10 mg/L，PI 50 mg/L)避光染色10 min，將樣本放入流式細胞儀的樣品室內(nèi)，激發(fā)波長488 nm，使用BDFACSDivaTm軟件收集數(shù)據(jù)，并用ModfitLT 3.0軟件進行細胞凋亡分析［6］。

2.7 細胞內(nèi)ROS的檢測 HEP-2細胞傳代培養(yǎng)24 h后，按實驗需要用不同濃度藻藍蛋白單用及與ROS抑制劑NAC(3 mmol/L)聯(lián)合處理48 h。收集細胞后懸浮于用無血清培養(yǎng)液稀釋好的DCFA-DA(終濃度為10 μmol/L)中，37℃避光孵育20 min，用無血清培養(yǎng)液清洗3次，流式細胞儀測定熒光強度(激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm)。實驗重復(fù)3次，所得數(shù)據(jù)經(jīng) Quest軟件收集、分析［7］。

2.8 Caspase活性的測定 Caspase-3、-8、-9活性的檢測采用比色法。收集經(jīng)0、80、160、320 mg/L藻藍蛋白處理24 h的HEP-2細胞，用細胞裂解液在冰上裂解20 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取 10 μL上清進行蛋白定量，于紫外分光光度計內(nèi)測樣本在595 nm下的吸光度值;另10 μL加80 μL檢測緩沖液及10 μL caspase反應(yīng)底物，混勻，37℃孵育2 h，測定樣本 A405，再計算 caspase 相對活性［8］。

2.9 RT-PCR檢測細胞凋亡調(diào)控基因mRNA的表達 收獲經(jīng)不同濃度藻藍蛋白(0、80、160、320 mg/L)培養(yǎng)48 h的HEP-2細胞，TRIzol法提取細胞總RNA，所得沉淀用0.1%DEPC水溶解，用Nano Drop 2000型超微量分光光度計檢測 RNA純度及濃度，取A260/280為1.8～2.0者用于RT反應(yīng)。參照TaKaRa公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進行cDNA合成，反應(yīng)體系為 20 μL，包括:總 RNA 1 μg，Prime Script RTase 1 μL，10 × Prime Script buffer 3 μL，RNase inhibitor 0.5 μL，dNTP Mix 1 μL，Random Primer 1 μL，加 RNA free H2O至20 μL。逆轉(zhuǎn)錄條件為30℃ 10 min，42℃ 45 min，95℃ 5 min，4℃ 30 min。PCR反應(yīng)體系按照試劑說明配制以β-actin為內(nèi)參照，所有引物序列詳見表1。反應(yīng)條件為94℃ 5 min;94℃ 40 s，58℃ 45 s，72℃ 50 s，35個循環(huán);72℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物5 μL進行瓊脂糖凝膠電泳并拍照，應(yīng)用凝膠圖像分析管理系統(tǒng)進行灰度測量，mRNA的表達水平以每一樣品與其內(nèi)參照β-actin灰度比值表示，實驗獨立重復(fù) 3 次［9］。

表1 用于RT-PCR分析的引物序列Table 1.The primers sequences for RT-PCR analysis

2.10 Western blot檢測細胞凋亡調(diào)控蛋白的表達收集前述方法培養(yǎng)并處理的細胞，用200 μL RIPA裂解液和1 μL PMSF 裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，留取上清，用 BCA蛋白試劑盒測蛋白濃度。在 30 μg體積下行 12%SDS-PAGE，后用PVDF膜轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉2 h。用1∶1 000比例稀釋Ⅰ抗，4℃孵育過夜。次日用TBST洗3次，每次15 min，按1∶3 000比例稀釋Ⅱ抗，37℃孵育2 h，接著用TBST洗膜，方法同前。最后滴加ECL液，暗室X線壓片曝光，顯影、定影，內(nèi)參照用β-actin。掃描X光片后，計算機軟件處理，進行密度分析，計算灰度值［10］。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，2組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 MTT法檢測藻藍蛋白對HEP-2細胞生長的影響

MTT結(jié)果顯示160 mg/L的藻藍蛋白作用12 h后，細胞的生長抑制率為2.83%，作用時間延長至72 h后，抑制率上升至61.85%，與不含藻藍蛋白的對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。這說明藻藍蛋白對人喉癌HEP-2細胞有明顯的抑制作用。

并且，藻藍蛋白對HEP-2細胞的抑制率增加，呈劑量依賴性。同時，48 h作用組與24 h作用組不同濃度下的抑制率之間有明顯差別(P＜0.05)，說明藻藍蛋白對喉癌HEP-2細胞生長的抑制作用呈時間依賴性。其24 h的IC50為431.86 mg/L，48 h的IC50為225.93 mg/L，見圖 1。

Figure 1.The inhibitory effect of phycocyanin on HEP-2 cell activity.Mean±SD.n=5.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs 0 mg/L;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs 12 h.圖1 藻藍蛋白對HEP-2細胞增殖的抑制作用

2 藻藍蛋白對人喉癌HEP-2細胞形態(tài)學(xué)影響

在倒置顯微鏡下觀察，對照組HEP-2細胞輪廓清晰，呈梭形、多邊形、上皮細胞樣，良好的貼壁生長，隨著培養(yǎng)時間的增長，細胞逐漸融合成片，在培養(yǎng)基中未見明顯懸浮細胞。隨著藻藍蛋白刺激濃度的增加，貼壁生長細胞逐漸減少，細胞間的連接減少，胞漿濃縮，邊緣不規(guī)則，變圓細胞和脫壁漂浮的小圓球細胞逐漸增多，到高濃度藻藍蛋白作用后(320 mg/L)貼壁生長細胞極少。由此可見，隨著藻藍蛋白處理時間的延長，鏡下出現(xiàn)形態(tài)學(xué)改變的細胞逐漸增多，見圖2。

Figure 2.The morphology of HEP-2 cells treated with phycocyanin for 48 h(×20).圖2 顯微鏡下觀察藻藍蛋白作用48 h后HEP-2細胞的形態(tài)

3 掃描電鏡觀察藻藍蛋白對HEP-2細胞表面形貌結(jié)構(gòu)的影響

對照組HEP-2細胞表面存在著豐富的微絨毛，在細胞邊緣有豐富的絲狀偽足，多且較長，呈放射狀向四周伸展。80 mg/L的藻藍蛋白作用后，部分細胞偽足回縮，多數(shù)細胞表面無明顯變化。160 mg/L的藻藍蛋白作用后，HEP-2細胞整體形態(tài)與對照組相比差別較為明顯，細胞表面微絨毛和偽足進一步減少或全部消失，細胞變得相對光滑，出現(xiàn)凋亡小體。隨著藥物濃度的繼續(xù)增加，細胞形態(tài)的改變愈加明顯，大多數(shù)細胞凹陷、變形、破損，表面呈空洞化或出現(xiàn)由峭狀、片層狀突起組成的結(jié)構(gòu)，有的細胞極度受損變形成為團塊狀細胞碎片或殘片，見圖3。

4 透射電鏡觀察藻藍蛋白對HEP-2細胞內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)的影響

對照組HEP-2細胞形態(tài)規(guī)則，表面有豐富的微絨毛，核規(guī)則，核仁清晰，靠近核膜一側(cè)的胞漿豐富，電子密度低，線粒體結(jié)構(gòu)完整，并可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及游離核糖體。隨著藻藍蛋白作用濃度的升高，各組HEP-2細胞形態(tài)變化明顯，細胞體積縮小，形態(tài)變得不規(guī)則，細胞器結(jié)構(gòu)不清，細胞質(zhì)中空泡增多，細胞核內(nèi)異染色質(zhì)增多，凝集成塊狀或聚集在核膜下，呈分葉狀、花瓣狀，核仁增大，數(shù)目增多，形態(tài)和位置不規(guī)則，大劑量組(320 mg/L PC)細胞膜碎裂，胞漿脫落，核膜消失，細胞核裂解為碎塊，見圖3。

5 喉癌HEP-2細胞凋亡的流式細胞檢測結(jié)果

Figure 3.Ultrastructural changes of HEP-2 cells treated with phycocyanin.圖3 電鏡觀察藻藍蛋白作用48 h后HEP-2細胞的超微結(jié)構(gòu)

藻藍蛋白作用HEP-2細胞48 h，與對照組相比，隨著藻藍蛋白給藥劑量的不斷增加，早期及晚期凋亡細胞所占比例逐漸增加，總凋亡率逐漸增加。藻藍蛋白濃度分別為20、40、80、160、320mg/L時，凋亡細胞占細胞總數(shù)的百分比分別為11.6%，14.6%，17.3%，18.9%，32.1%。各濃度組凋亡細胞比率與對照組比較，差異顯著(P＜0.05)。說明藻藍蛋白在20 mg/L～320 mg/L濃度范圍內(nèi)呈濃度依賴性誘導(dǎo)喉癌HEP-2細胞發(fā)生凋亡，見圖4。

6 藻藍蛋白對HEP-2細胞內(nèi)ROS水平的影響

隨著藻藍蛋白濃度的增加，PC組和PC+NAC組ROS熒光強度也隨之增強(P＜0.01)，單獨使用NAC處理的HEP-2細胞熒光強度無明顯變化。經(jīng)320 mg/L藻藍蛋白處理的HEP-2細胞內(nèi)熒光強度為對照組的3.2倍(P＜0.01);而當(dāng)藻藍蛋白聯(lián)合ROS抑制劑NAC處理HEP-2細胞時，細胞內(nèi)熒光強度雖比PC組低(P＜0.05)，但仍高于對照組(P＜0.05)，說明藻藍蛋白處理HEP-2細胞后能使細胞內(nèi)ROS水平明顯升高，且細胞內(nèi)ROS水平的升高可被ROS抑制劑抑制，見圖5。

7 Caspase活性測定

不同濃度藻藍蛋白處理HEP-2細胞后，caspase-3、caspase-8和caspase-9的活性明顯升高且具有濃度依賴性(P＜0.05)，見表2，表明藻藍蛋白誘導(dǎo)的細胞凋亡是caspase依賴型的。

8 RT-PCR檢測結(jié)果

經(jīng)不同濃度藻藍蛋白作用48 h后，HEP-2細胞Bax、P53、Fas、caspase-3 和 caspase-9 的 mRNA 表達出現(xiàn)上調(diào)，抗凋亡基因Bcl-2的mRNA表達出現(xiàn)下調(diào)，并表現(xiàn)出一定的劑量依賴性。320 mg/L的藻藍蛋白處理組與對照組相比，Bax、Fas、P53、caspase-3和caspase-9 mRNA的表達分別增加了1.6倍、1.8倍、1.9倍、2.6倍和1.7倍，Bcl-2的表達降低了0.6倍，和空白對照組比較差異顯著(P＜0.05)，見圖6。

9 Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白表達

在本實驗中，采用了Western blot方法檢測各組細胞P53和caspase-3蛋白水平的改變。結(jié)果顯示不同濃度的藻藍蛋白(80、160、320 mg/L)給藥后，HEP-2細胞P53蛋白 和caspase-3的活化片段(17 kD)逐漸增多，和空白對照組比較差異顯著(P＜0.05)，與RT-PCR和caspase活性檢測結(jié)果是一致的，見圖7。

討 論

藻藍蛋白是從螺旋藻中提取的一種捕光色素蛋白，捕光效能高，屬于藻膽蛋白的一種，主要由α和β兩種亞基組成，天然狀態(tài)下多以多聚體形式存在。近年來在海洋生物中尋找高效、低毒、不良反應(yīng)小的抗腫瘤藥物受到越來越多的關(guān)注［11］。本實驗結(jié)果顯示藻藍蛋白能夠抑制HEP-2細胞增殖并誘導(dǎo)細胞凋亡，且有一定劑量效應(yīng)關(guān)系。

Figure 4.The effects of phycocyanin on apoptosis of HEP-2 cells.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs 0 mg/L.圖4 不同濃度藻藍蛋白對HEP-2細胞凋亡的影響

Figure 5.The effects of phycocyanin on ROS production in HEP-2 cells.NAC:N-acetylcysteine.Mean ± SD.n=3.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs 0 mg/L;#P ＜0.05 vs PC.圖5 不同濃度藻藍蛋白對HEP-2細胞內(nèi)ROS水平的影響

細胞凋亡的發(fā)生是一個級聯(lián)式基因表達的結(jié)果，主要通過3條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑產(chǎn)生:線粒體途徑、死亡受體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號途徑。而3條信號途徑最終都通過引發(fā)凋亡中心環(huán)節(jié)caspase-3的激活，形成級聯(lián)反應(yīng)，進而誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生凋亡。Caspase家族在凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮著重要作用，其中caspase-8和caspase-9為凋亡的效應(yīng)分子，分別與凋亡的死亡受體通路和線粒體通路相關(guān);而caspase-3為關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行分子，它在凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能。本文進一步檢測了藻藍蛋白處理后HEP-2細胞中caspase的活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)caspase-3、-8、-9均被激活，說明藻藍蛋白不僅能夠介導(dǎo)細胞凋亡的線粒體通路的活化，而且能夠活化死亡受體通路。

表2 不同濃度藻藍蛋白作用于HEP-2細胞后caspase活性的變化Table 2.The results of caspase activities in the HEP-2 cells treated with phycocyanin at different concentrations(Mean±SD.n=3)

Figure 6.The effects of phycocyanin on the mRNA expression of apoptosis-related genes in HEP-2 cells tested by RT-PCR.β-actin was used as an internal control.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs 0 mg/L.圖6 RT-PCR檢測藻藍蛋白對HEP-2細胞凋亡調(diào)控基因mRNA表達的影響

Figure 7.The effects of phycocyanin on the protein levels of P53 and cleaved caspase-3 determined by Western blot.βactin was used as an internal control.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs 0 mg/L.圖7 Western blot檢測藻藍蛋白對 HEP-2細胞 P53和cleaved caspase-3蛋白水平的影響

在線粒體凋亡途徑中，Bcl-2和Bax蛋白是線粒體完整性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者，Bcl-2與Bax可形成異源二聚體或與自身形成同源二聚體，參與調(diào)節(jié)細胞線粒體凋亡途徑。14-噻吩基次亞甲基苦參堿對人鼻咽癌CNE細胞的誘導(dǎo)凋亡機制與激活線粒體凋亡通路(上調(diào) Bax的表達并下調(diào) Bcl-2的表達)有關(guān)［12］。Subhashini等［13］研究表明C-PC通過細胞色素C從線粒體釋放進入細胞質(zhì)，引起B(yǎng)cl-2的下調(diào)從而誘導(dǎo)K562細胞凋亡。我們在研究中發(fā)現(xiàn)，藻藍蛋白作用于HEP-2細胞后，Bcl-2表達下降，Bax、caspase-9和caspase-3表達增加，并表現(xiàn)出一定的劑量依賴性，藻藍蛋白可能通過抑制Bcl-2，激活Bax而釋放細胞色素C，釋放到細胞質(zhì)中的細胞色素C通過形成凋亡小體而啟動caspase依賴的線粒體途徑的細胞凋亡。

Fas/FasL介導(dǎo)的通路也是引起細胞凋亡的重要途徑之一，F(xiàn)as/Apol屬于腫瘤壞死因子受體超家族，是細胞膜上的糖基化穿膜蛋白。Fas和FasL均主要以膜形式存在，二者結(jié)合可引起多種細胞的凋亡。研究發(fā)現(xiàn)許多腫瘤細胞具有較高水平FasL表達，而Fas則表達明顯下降，在發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤 Fas幾乎完全消失［14］。在本研究中藻藍蛋白可明顯上調(diào)HEP-2細胞Fas的表達水平。因而可推測藻藍蛋白誘導(dǎo)HEP-2細胞凋亡可能是通過上調(diào)細胞膜表面的 Fas抗原表達，進而激活caspase啟動HEP-2細胞內(nèi)的凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)細胞凋亡，這與李冰等［8］的研究結(jié)果一致。

ROS是生物體內(nèi)重要的信號分子并對生物生長發(fā)育有重要意義。正常情況下，細胞內(nèi)ROS處于一個相對穩(wěn)定的水平，但理化和生物因素的刺激可導(dǎo)致細胞內(nèi)ROS大量增加［7］。ROS與線粒體、死亡受體介導(dǎo)的細胞凋亡均有關(guān)聯(lián)，且在藥物作用下誘導(dǎo)細胞凋亡的作用更為明顯。本研究發(fā)現(xiàn)藻藍蛋白處理HEP-2細胞后能使細胞內(nèi)ROS水平明顯升高，且細胞內(nèi)ROS水平的升高可被ROS抑制劑NAC抑制，說明細胞內(nèi)ROS升高在藻藍蛋白誘導(dǎo)細胞凋亡中起著非常重要的作用，藻藍蛋白可打破細胞內(nèi)氧化還原平衡，引發(fā)細胞內(nèi)ROS升高，而后者可能作為活化信號，激活細胞凋亡途徑，從而促進細胞凋亡。這與Bobbili等［15］認為自由基消除劑能夠抑制藻藍蛋白介導(dǎo)的AK-5腫瘤細胞的凋亡的結(jié)論相符。

另外，p53是細胞內(nèi)重要的抑癌基因，在本實驗中，RT-PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示給藥后細胞P53表達增加，且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性，其效果與Ad-ING4-OSM聯(lián)合放療抑制喉癌HEP-2細胞生長［16］、槐定堿聯(lián)合順鉑誘導(dǎo)人宮頸腺癌HeLa細胞凋亡［17］相當(dāng)。藻藍蛋白誘導(dǎo)HEP-2細胞凋亡可能是通過P53介導(dǎo)的凋亡途徑，但有關(guān)P53蛋白與凋亡發(fā)生的具體機制尚有待于進一步的研究。

綜上所述，藻藍蛋白誘導(dǎo)HEP-2細胞凋亡是線粒體途徑和死亡受體途徑激活同時參與的結(jié)果。這反映了藻藍蛋白多層次、多靶點的作用優(yōu)勢。當(dāng)然，藻藍蛋白對于腫瘤細胞的抑制作用是一個很復(fù)雜的問題，本實驗僅從對于腫瘤細胞的增殖和凋亡的影響做了一些探索，可能還有其它方面的因素參與其中，還有待深入研究。

［1］ Zhang W，Geng T，Han W，et al.Tea intake and risk of oral，pharyngeal，and laryngeal carcinoma:a meta-analysis［J］.Med Sci Monit，2014，20:2142-2150.

［2］ 趙永強.塞來昔布誘導(dǎo)喉癌Hep-2細胞凋亡及細胞周期阻滯的實驗研究［D］.濟南:山東大學(xué)，2014.

［3］ Zhang YY，Chen BL.Rose algal phycocyanin purification and vitro antioxidant activity［J］.Food Fermentation Industries，2012，8(9):38-43.

［4］ 趙德璋，羅子國，楊杰順.改良游離細胞掃描電鏡制樣方法適用于凋亡細胞觀察［J］.電子顯微學(xué)報，2013，32(6):492-495.

［5］ 王盛蘭，鐘延豐，管增偉，等.電鏡和熒光顯微鏡技術(shù)在細胞凋亡研究中的應(yīng)用［J］.北京大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2003，35(1):91-93.

［6］ 王雯婕，陳 劍，劉小勇，等.白藜蘆醇對視網(wǎng)膜色素上皮細胞增殖的影響［J］.中國病理生理雜志，2014，30(10):1839-1844.

［7］ 范麗麗，李偉華.外源性NO誘導(dǎo)胃癌SGC-7901細胞凋亡的作用機制［J］.世界華人消化雜志，2015，23(1):8-15.

［8］ 李 冰，褚現(xiàn)明，高美華，等.鈍頂螺旋藻藻藍蛋白誘導(dǎo)HeLa細胞凋亡的分子機制研究［J］.中國藥理學(xué)通報，2009，25(8):1045-1050.

［9］ 王和峰，翟純剛，龐文會，等.PI3K/Akt/mTOR信號通路在巨噬細胞自噬及動脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定中的作用［J］.中國病理生理雜志，2013，29(3):390-397.

［10］ Lu W，Yu P，Li J.Induction of apoptosis in human colon carcinoma COLO 205 cells by the recombinant a subunit of C-phycocyanin［J］.Biotechnol Lett，2011，33(3):637-644.

［11］ Li B，Chu X，Gao M，et al.Apoptotic mechanism of MCF-7 breast cells in vivo and in vitro induced by photodynamic therapy with C-phycocyanin［J］.Acta Biochim Biophys Sin，2010，42(1):80-89.

［12］ 陳 俊.14-噻吩基次亞甲基苦參堿抗鼻咽癌作用及機制的實驗研究［D］.南寧:廣西醫(yī)科大學(xué)，2013.

［13］ Subhashini J，Mahipal SV，Reddy MC，et al.Molecular mechanisms in C-phycocyanin induced apoptosis in human chronic myeloid leukemia cell line-K562［J］.Biochem Pharmacol，2004，68(3):453-462.

［14］ B?benek M，Du＇s D，Ko＇zlak J.Prognostic value of the Fas/Fas ligand system in breast cancer［J］.Contemp Oncol(Pozn)，2013，17(2):120-122.

［15］ Pardhasaradhi BV，ALi AM，Kumari AL，et al.Phycocyanin-mediated apoptosis in AK-5 tumor cells involves down-regulation of Bcl-2 and generation of ROS［J］.Mol Cancer Ther，2003，2(11):1165-1170.

［16］ 王 飛.Ad-ING4-OSM聯(lián)合放療對喉癌抑瘤增效的體內(nèi)外實驗研究［D］.蚌埠:蚌埠醫(yī)學(xué)院，2012.

［17］ 馬小萍.槐定堿聯(lián)合順鉑對宮頸腺癌HeLa細胞增殖抑制作用的研究［D］.蘭州:蘭州大學(xué)，2014.