孫　云，柳　剛，李學(xué)剛，時(shí)一民，關(guān)廣聚△(山東大學(xué)第二醫(yī)院血液凈化科，濟(jì)南市委門(mén)診部，山東濟(jì)南50033)

左卡尼汀抑制尿毒癥血清誘導(dǎo)的紅細(xì)胞衰亡

孫云1，柳剛1，李學(xué)剛1，時(shí)一民2，關(guān)廣聚1△
(1山東大學(xué)第二醫(yī)院血液凈化科，2濟(jì)南市委門(mén)診部，山東濟(jì)南250033)

［摘要］目的:探討左卡尼汀對(duì)尿毒癥患者紅細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制。方法:將2%健康人紅細(xì)胞懸液在以下3組不同的體外培養(yǎng)液中孵育:對(duì)照組( C組)、尿毒癥血清組( U組)和尿毒癥血清+左卡尼汀組( L組)。分別在孵育24和48 h時(shí)，留取紅細(xì)胞，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)紅細(xì)胞衰亡(用磷脂酰絲氨酸表達(dá)率代表紅細(xì)胞衰亡)和紅細(xì)胞活性氧簇( ROS)的含量，并采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)紅細(xì)胞谷胱甘肽( GSH)的含量。結(jié)果:紅細(xì)胞衰亡隨孵育時(shí)間延長(zhǎng)而增加，U組較C組明顯增加，L組較U組明顯降低。U組的紅細(xì)胞ROS生成較C組明顯增加，而紅細(xì)胞GSH生成明顯減少。L組的紅細(xì)胞ROS生成較U組明顯減少，而GSH生成明顯增加。結(jié)論:尿毒癥血清誘導(dǎo)正常紅細(xì)胞加速衰亡，且衰亡率具有時(shí)間依賴性。而左卡尼汀可以抑制尿毒癥血清誘導(dǎo)的紅細(xì)胞衰亡，其機(jī)制可能與抗氧化有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］尿毒癥血清;紅細(xì)胞衰亡;左卡尼汀;氧化應(yīng)激

腎性貧血為慢性腎衰竭常見(jiàn)并發(fā)癥之一。導(dǎo)致腎性貧血主要原因?yàn)榇偌t細(xì)胞生成素( erythropoietin，EPO)分泌減少、鐵劑缺乏、紅細(xì)胞壽命縮短等，多數(shù)患者在補(bǔ)充EPO和鐵劑后能夠得到有效糾正。但是在臨床上仍有效果不佳者，稱為難治性貧血。研究發(fā)現(xiàn)左卡尼汀( L-carnitine，LC)對(duì)該類(lèi)難治性貧血有一定療效［1-2］，其相關(guān)機(jī)制可能與LC改變了紅細(xì)胞膜的滲透脆性等［3-4］因素有關(guān)。LC是脂肪動(dòng)員的輔因子，可以通過(guò)加強(qiáng)脂肪β氧化供能，還具有抗炎、抗凋亡、抗氧化等作用，臨床上常用于治療心力衰竭或繼發(fā)性肉堿缺乏癥，而維持性血液透析是繼發(fā)性肉堿缺乏癥的常見(jiàn)原因之一。本研究旨在通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)觀察LC對(duì)尿毒癥血清中紅細(xì)胞的保護(hù)作用并探討相關(guān)機(jī)制，以期為臨床防治腎性貧血提供新的思路和途徑。

材料和方法

1材料

左卡尼汀注射液、PBS液和2’，7’-二氯二氫熒光素二乙酯( DCFH-DA)均購(gòu)自Sigma;谷胱甘肽( glutathione，GSH)檢測(cè)試劑盒(上海碧云天) ; Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(南京凱基) ; 0.22 μm無(wú)菌濾器( Millipore) ;無(wú)菌12孔板( Greiner)。高速離心機(jī)(上海安亭) ;－80℃冰箱(青島海爾) ;無(wú)菌工作臺(tái)( ESCO Class II) ;二氧化碳培養(yǎng)箱( MCO-18AIC) ;流式細(xì)胞儀( BD) ;酶標(biāo)儀(安圖2010)。

2血清制備

選取慢性腎功能衰竭維持性血液透析患者20例，其中男12例，女8例，平均年齡( 42.3±2.1)歲。該實(shí)驗(yàn)通過(guò)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書(shū)。入選標(biāo)準(zhǔn): ( 1)均已進(jìn)行維持性血液透析1年以上; ( 2)血壓控制在150/90 mmHg以下; ( 3)近期無(wú)明顯感染、重度心力衰竭; ( 4)無(wú)糖尿病病史。所選病例中原發(fā)疾病為腎小球腎炎8例、原發(fā)性高血壓7例和藥物性腎損傷5例。透析前清晨空腹采靜脈血8 mL，標(biāo)本用普通生化管裝盛，30 min內(nèi)離心( 3 000 r/min)，收集上清置于2 mL的無(wú)菌EPPendorf管中。無(wú)菌條件下留取、分離，－20℃冷凍保存，10 d內(nèi)備用，實(shí)驗(yàn)時(shí)所有混合血清用0.22 μm的無(wú)菌濾膜過(guò)濾除菌后使用。混合血清的肌酐( serum creatinine，SCr)值為( 1 373.34±23.56) μmol/L，尿素氮( blood urea nitrogen，BUN)值為( 78. 65±12.95) mmol/L。根據(jù)需要配制成為所需濃度的尿毒癥血清培養(yǎng)液。

3實(shí)驗(yàn)方法

3.1外周血紅細(xì)胞的體外孵育清晨抽取健康志愿者空腹靜脈血10 mL，EDTA抗凝，用PBS調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109/L(即2%的紅細(xì)胞懸液)。紅細(xì)胞置于12孔板，加入如下不同培養(yǎng)基后，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。

3.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將新鮮配置的2%紅細(xì)胞懸液按照不同的體外培養(yǎng)基分成以下3組: ( 1)正常對(duì)照( control，C)組:培養(yǎng)基為PBS溶液; ( 2)尿毒癥血清( uremic serum，U)組:培養(yǎng)基為30%尿毒癥血清+ 70%PBS溶液; ( 3) LC( L)組:培養(yǎng)基為30%尿毒癥血清+70%PBS溶液+ LC(終濃度調(diào)節(jié)為200 μmol/ L)。設(shè)24 h和48 h 2個(gè)觀察點(diǎn)，定點(diǎn)收集孵育中的紅細(xì)胞，離心，洗滌，至少2次。并在1 h內(nèi)測(cè)定相關(guān)數(shù)據(jù)。其中L組紅細(xì)胞提前加入相應(yīng)濃度的LC孵育2 h后，PBS洗滌，再加入LC與其它2組同時(shí)開(kāi)始孵育。每個(gè)觀察點(diǎn)設(shè)有3個(gè)平行對(duì)照孔，相同實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，測(cè)得同一時(shí)點(diǎn)數(shù)據(jù)后，取平均值作為該時(shí)點(diǎn)最終值。

3.3檢測(cè)紅細(xì)胞衰亡率細(xì)胞凋亡早期的特征之一是細(xì)胞外膜表達(dá)磷脂酰絲氨酸( phosphatidylserine，PS)。Annexin V是一種分子量為35～36 kD 的Ca2 +依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與PS具有高度親和力，故可通過(guò)細(xì)胞外膜暴露的PS與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。因此Annexin V被作為檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。紅細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞核，故將紅細(xì)胞凋亡特稱為紅細(xì)胞衰亡( eryptosis)。當(dāng)紅細(xì)胞早期衰亡時(shí)，同樣表達(dá)PS。故Annexin V測(cè)定的PS表達(dá)率可代表紅細(xì)胞衰亡。將收集到的紅細(xì)胞用PBS洗滌后，加入緩沖液、10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 min。流式細(xì)胞儀選擇激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm，作為檢測(cè)紅細(xì)胞衰亡的指標(biāo)。

3.4檢測(cè)紅細(xì)胞內(nèi)活性氧簇( reactive oxygen species，ROS)的含量加入以PBS稀釋熒光探針DCFH-DA，使其終濃度為10 μmol/L。37℃搖床孵育20min，使探針與細(xì)胞充分結(jié)合，DCFH-DA與ROS反應(yīng)后生成帶有熒光特性的二氯熒光素。PBS洗滌細(xì)胞3次，徹底去除未進(jìn)入細(xì)胞的DCFH-DA。PBS將紅細(xì)胞重懸后，流式細(xì)胞儀選擇激發(fā)波長(zhǎng)488 nm、發(fā)射波長(zhǎng)530 nm檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

3.5檢測(cè)紅細(xì)胞GSH利用ELISA原理，按試劑盒說(shuō)明，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)紅細(xì)胞GSH的含量。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均用SPSS 12. 0處理，所有計(jì)數(shù)資料均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤( mean±SEM)表示，多個(gè)組間比較采用單因素方差分析( one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法( LSD法)。兩指標(biāo)間相關(guān)性采用Pearson法。以P＜0. 05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1健康人紅細(xì)胞在不同培養(yǎng)基中的衰亡率

隨著體外孵育時(shí)間延長(zhǎng)，紅細(xì)胞衰亡增加。加入尿毒癥血清后，紅細(xì)胞衰亡較C組明顯增加。而同時(shí)加入左卡尼汀后，紅細(xì)胞衰亡較U組明顯降低，見(jiàn)圖1、表1。

Figure 1.The result of eryptosis detected by flow cytometry.圖1　流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)紅細(xì)胞細(xì)胞衰亡率

2健康人紅細(xì)胞在不同培養(yǎng)基中的ROS和GSH

隨著體外孵育時(shí)間延長(zhǎng)，紅細(xì)胞ROS生成增加，GSH生成減少。當(dāng)加入尿毒癥血清后，二者變化更為明顯，即U組紅細(xì)胞ROS生成較C組明顯增加，同時(shí)紅細(xì)胞GSH生成明顯減少。當(dāng)加入左卡尼汀后，L組紅細(xì)胞ROS生成較U組明顯減少，紅細(xì)胞GSH生成明顯增加，見(jiàn)圖2、表1。

3氧化應(yīng)激與紅細(xì)胞衰亡的相關(guān)性分析

以ROS和GSH為氧化應(yīng)激指標(biāo)，進(jìn)一步分析其與紅細(xì)胞衰亡的相關(guān)性，結(jié)果顯示紅細(xì)胞衰亡與ROS呈正相關(guān)，GSH與ROS呈負(fù)相關(guān)，見(jiàn)表2。

討論

腎性貧血的普遍存在直接影響慢性腎功衰竭患者的生存質(zhì)量，降低了維持性腎臟替代治療患者生存率，故有效治療腎性貧血具有重要的臨床意義。本研究使用尿毒癥血清和LC刺激健康紅細(xì)胞，通過(guò)觀察紅細(xì)胞衰亡的變化發(fā)現(xiàn)LC的保護(hù)作用，并同時(shí)觀察了紅細(xì)胞氧化應(yīng)激的相關(guān)指標(biāo)的變化。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)加入尿毒癥血清而模擬尿毒癥內(nèi)環(huán)境，結(jié)果顯示，健康紅細(xì)胞體外孵育時(shí)，隨孵育時(shí)間延長(zhǎng)衰亡發(fā)生增加。加入尿毒癥血清后，在相同觀察時(shí)點(diǎn)紅細(xì)胞衰亡增加，這與Bonomini等［5］研究結(jié)果一致，提示血液透析患者的內(nèi)環(huán)境可以誘導(dǎo)紅細(xì)胞過(guò)度衰亡。尿毒癥患者的紅細(xì)胞壽命縮短(由正常的120 d縮短至90 d左右)，這是腎性貧血的重要原因之一，其中過(guò)多的紅細(xì)胞衰亡是導(dǎo)致紅細(xì)胞壽命縮短的直接原因。已有多項(xiàng)證據(jù)指出糖尿病、膿毒血癥、地中海貧血、慢性腎功衰竭等多種疾病的各種不同內(nèi)環(huán)境條件均能導(dǎo)致紅細(xì)胞衰亡［6］。紅細(xì)胞衰亡具有多重生理作用，直接促進(jìn)貧血的發(fā)生，或者PS表達(dá)造成細(xì)胞之間黏附，激活凝血過(guò)程。Bonomini等［5］的研究還證實(shí)紅細(xì)胞的衰亡是可逆的，他將尿毒癥血清中的紅細(xì)胞又重新移至健康人血清中，紅細(xì)胞衰亡減少。這提示我們通過(guò)抑制或者逆轉(zhuǎn)紅細(xì)胞衰亡有可能成為治療貧血的有效方法。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了LC對(duì)尿毒癥血清中的紅細(xì)胞發(fā)揮了抗凋亡的作用，減少了紅細(xì)胞的凋亡。

Figure 2.ROS production in the erythrocytes detected by flow cytometry，and the blue area represents the level of ROS.圖2　流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)紅細(xì)胞ROS

表1　體外紅細(xì)胞孵育的不同時(shí)點(diǎn)PS、ROS和GSH水平Table 1.The results of eryptosis，ROS and GSH at different times ( Mean±SEM.n =6 )

表2　在不同觀察時(shí)點(diǎn)各指標(biāo)間相關(guān)性分析Table 2.The correlation analysis of different index at different time points

氧化應(yīng)激與多種細(xì)胞的凋亡具有密不可分的關(guān)系［7］，而抗氧化藥物可通過(guò)減輕氧化應(yīng)激而發(fā)揮抗凋亡作用［8］。本研究中，在紅細(xì)胞衰亡增加的同時(shí)，紅細(xì)胞的ROS增加和GSH減少，且在不同的觀察時(shí)點(diǎn)紅細(xì)胞衰亡率與ROS呈正相關(guān)，與GSH呈負(fù)相關(guān)。這提示紅細(xì)胞衰亡與氧化應(yīng)激之間存在一定的聯(lián)系，氧化產(chǎn)物促進(jìn)衰亡，而抗氧化產(chǎn)物抑制衰亡。那么我們推測(cè)尿毒癥血清可能通過(guò)增強(qiáng)氧化應(yīng)激而誘導(dǎo)紅細(xì)胞衰亡。尿毒癥內(nèi)環(huán)境的氧化應(yīng)激產(chǎn)物對(duì)紅細(xì)胞產(chǎn)生不良影響。維持性血液透析患者反復(fù)的接觸透析材料和透析液，貧血治療過(guò)程中大量補(bǔ)充鐵劑等都導(dǎo)致大量活性氧產(chǎn)生［9］。Usberti等［10］證實(shí)過(guò)度氧化應(yīng)激增加紅細(xì)胞衰亡，是引起尿毒癥貧血的原因之一。這就提示抗氧化藥物或許有利于治療腎性貧血。LC具有抗氧化的藥理作用。LC可以延長(zhǎng)維持性血液透析患者紅細(xì)胞的壽命，Arduini等［11］在臨床研究中證實(shí)對(duì)維持血液透析患者靜脈補(bǔ)充LC24周后，紅細(xì)胞壽命相對(duì)明顯延長(zhǎng)了8.5 d。我們用LC對(duì)含有尿毒癥血清的培養(yǎng)液中紅細(xì)胞進(jìn)行了干預(yù)，同步觀察氧化應(yīng)激產(chǎn)物指標(biāo)ROS和抗氧化應(yīng)激指標(biāo)GSH變化。我們發(fā)現(xiàn)加入LC后紅細(xì)胞衰亡明顯減少，并且也伴隨著ROS明顯減少和GSH明顯增加，且各指標(biāo)相互間存在著顯著的相關(guān)性。說(shuō)明LC通過(guò)減輕氧化應(yīng)激抑制紅細(xì)胞衰亡。這也提示LC對(duì)于尿毒癥血清中的紅細(xì)胞來(lái)說(shuō)，是一種有效的氧自由基清除劑，它通過(guò)減輕氧化應(yīng)激保護(hù)了紅細(xì)胞。

綜上所述，本研究體外模擬尿毒癥內(nèi)環(huán)境，并加入LC進(jìn)行干預(yù)，觀察了紅細(xì)胞衰亡率和ROS、GSH的變化，提示LC可能通過(guò)減輕氧化應(yīng)激而抑制尿毒癥血清誘導(dǎo)的紅細(xì)胞衰亡，發(fā)揮治療腎性貧血的作用。

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L-carnitine inhibits eryptosis induced by uremic serum

SUN Yun1，LIU Gang1，LI Xue-gang1，SHI Yi-min2，GUAN Guang-ju1
(1Department of Hemodialysis，The Second Hospital of Shandong University，2The Outpatient Department of Jinan Municipal Committee，Jinan 250033，China.E-mail: guangj@ sdu.edu.cn)

［ABSTRACT］AIM: To investigate whether L-carnitine ( LC) inhibits the eryptosis effect of uremic serum on erythrocytes.METHODS: Erythrocyte suspension ( 2%) was cultured and divided into 3 groups in vitro: control group ( C group)，uremic serum group ( U group，30% uremic serum)，and uremic serum + LC group ( L group，30% uremic serum +200 μmol/L LC).Erythrocytes were collected at 24 h and 48 h.Eryptosis ( phosphatidylserine expression represents eryptosis) was estimated by flow cytometry with Annexin V staining.The content of reactive oxygen species ( ROS) was also detected.Glutathione ( GSH) was measured by ELISA.RESULTS: Eryptosis in C group was increased as the incubating time extended.Eryptosis in U group was higher than that in C group，while that in L group was lower than that in U group.Meanwhile，ROS content was higher and GSH was lower in U group than those in C group.ROS content was lower and GSH was higher in L group than those in C group.CONCLUSION: LC inhibits uremic serum-induced eryptosis by decreasing ROS and increasing GSH，thus attenuating oxidative stress.

［KEY WORDS］Uremic serum; Eryptosis; L-carnitine; Oxidative stress

通訊作者△Tel: 0531-85875449; E－mail: guangj@ sdu.edu.cn

［收稿日期］2014-12-08［修回日期］2015-05-15

［文章編號(hào)］1000-4718( 2015)07-1324-05

［中圖分類(lèi)號(hào)］R363

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.07.031