張惠丹，汪薇，2*，白衛(wèi)東，2，何洛強(qiáng)

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東廣州510225；2.廣東省嶺南特色食品工程技術(shù)研究中心，廣東廣州510225；3.廣東銘康香精香料有限公司，廣東廣州510000）

復(fù)合酶水解奶油制備天然奶味香基的工藝研究

張惠丹1，汪薇1，2*，白衛(wèi)東1，2，何洛強(qiáng)3

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東廣州510225；2.廣東省嶺南特色食品工程技術(shù)研究中心，廣東廣州510225；3.廣東銘康香精香料有限公司，廣東廣州510000）

采用脂肪酶和蛋白酶組成的復(fù)合酶制劑作為催化劑，酶解奶油制備天然奶味香基。結(jié)果表明，當(dāng)酶解溫度為40℃，酶解時(shí)間7 h，奶油濃度為95%，酶添加量為1.0%，乳清液添加量為25%，脂肪酶A與復(fù)合蛋白酶比例為2∶1時(shí)，所制得的天然奶味香基為甜奶香型，其香氣自然、柔和、圓潤(rùn)，此時(shí)所產(chǎn)奶味香基的酸價(jià)在18～21 mg/g之間，感官評(píng)分值可達(dá)到70以上。

天然奶味香基；奶油；脂肪酶；復(fù)合蛋白酶；酸價(jià)

奶味香精是食品工業(yè)中應(yīng)用最為廣泛的香精之一，主要用于糖果、飲料、冷食、焙烤食品等的增香，還可用于飼料的加香，改善飼料的適口性[1-5]。奶味香精對(duì)食品風(fēng)味起著舉足輕重的作用，添加合適的香精，其香氣、口味將會(huì)有意想不到的改善，可以給食品原料賦香，矯正食品中的不良?xì)馕?，也可以補(bǔ)充食品中原有香氣的不足，穩(wěn)定和輔助食品中的固有香氣。

酶法制備奶味香基是指以稀奶油、牛奶等為主要原料，通過(guò)脂肪酶的作用將脂肪酸（飽和與不飽和的）、甘油三脂、酮酸和羥酸的甘油三酯酶解成飽和及不飽和脂肪酸、酮酸和羥酸，形成多種風(fēng)味成分的前體物質(zhì)，經(jīng)過(guò)自然的氧化、斷裂、內(nèi)酯化等反應(yīng)產(chǎn)生一系列風(fēng)味物質(zhì)。脂肪酸中偶數(shù)碳的香氣貢獻(xiàn)較大，羥酸進(jìn)一步脫水環(huán)化生成不同碳數(shù)的丙、丁位內(nèi)酯，尤其是偶數(shù)碳丁位內(nèi)酯，其含量雖少，香氣貢獻(xiàn)卻很大[6-7]。因此以奶油為原料，通過(guò)脂肪酶水解作用得到的酶解奶油，再以酶解奶油為基料加以適當(dāng)修飾，即可得到天然奶味香精[8-14]。本文采用脂肪酶和蛋白酶組成的復(fù)合酶制劑作為催化劑，酶解奶油制備甜奶香型天然奶味香基，為天然奶味香基的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

奶油：市售；蛋白乳清粉：廣州市日鋒畜牧有限公司；脂肪酶A（lipase A）來(lái)源于黑曲霉（Aspergillus niger）、脂肪酶AY（lipase AY）來(lái)源于新篩選的皺摺假絲酵母（Candida rugosa）、脂肪酶G（lipase G）來(lái)源于青霉（Penicillium camemberti）、脂肪酶R（lipase R）來(lái)源于青霉（Penicillum roqueforti）：阿瑪諾天野酶制劑商貿(mào)（上海）有限公司；復(fù)合蛋白酶：廣東匯香源生物科技有限公司。乙醚、無(wú)水乙醇、KOH、酚酞等均為市售分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

THC-C恒溫振蕩器：太倉(cāng)市試驗(yàn)設(shè)備廠；JJ500精密電子天平：上海精勝科學(xué)儀器有限公司；HH數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市金成國(guó)勝試驗(yàn)儀器廠；DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 乳清液的配制

稱取一定量的乳清粉，再用乳清粉質(zhì)量3倍的水溶解，混合均勻待用。

1.3.2 酶解工藝流程及操作要點(diǎn)

酶解工藝流程如下：

稱取奶油→添加水和乳清液→85℃巴氏滅菌5 min→降溫至30～45℃→添加脂肪酶和復(fù)合蛋白酶→于設(shè)定溫度（35～45℃）下水解一定時(shí)間→85℃滅酶30 min→酸價(jià)測(cè)定→香氣評(píng)分

操作要點(diǎn)：將無(wú)水奶油溶解之后，與適量乳清液按一定比例加入具塞三角瓶中攪拌均勻，于85℃進(jìn)行預(yù)殺菌。降溫至30～45℃之后，加入脂肪酶和復(fù)合蛋白酶，置于恒溫振蕩器中在180 r/min的條件下進(jìn)行酶解，反應(yīng)一段時(shí)間后，將三角瓶置于恒溫水浴鍋中開始滅酶（85℃、30 min）。酶解過(guò)后對(duì)產(chǎn)生的香氣進(jìn)行香氣評(píng)分，并取其上清液測(cè)定酸價(jià)。

1.3.3 脂肪酶的篩選

在4個(gè)50 mL具塞三角瓶中分別加入12 g奶油，添加水至15 g，然后分別添加奶油質(zhì)量的1%的不同的脂肪酶（lipase A、lipase G、lipase R、lipase AY），置于恒溫氣浴振蕩器中開始反應(yīng)（40℃、180 r/min），酶解4 h后置于恒溫水浴鍋中開始滅酶（85℃、30 min），滅酶過(guò)后對(duì)產(chǎn)生的香氣進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，并取其上清液測(cè)定酸價(jià)。

1.3.4 不同因素對(duì)酶解奶油產(chǎn)香的影響

（1）溫度對(duì)酶解奶油產(chǎn)香的影響

在5個(gè)50 mL具塞三角瓶中分別加入12 g奶油，添加水至15 g，然后分別添加奶油質(zhì)量的1%的酶量（脂肪酶與復(fù)合蛋白酶比例為2∶1），置于不同溫度的恒溫氣浴振蕩器中開始反應(yīng)，溫度設(shè)置為30℃、35℃、40℃、45℃、50℃，轉(zhuǎn)速180 r/min，酶解4 h后置于恒溫水浴鍋中開始滅酶（85℃、30 min），滅酶過(guò)后對(duì)產(chǎn)生的香氣進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，并取其上清液測(cè)定酸價(jià)。

（2）奶油濃度對(duì)酶解奶油產(chǎn)香的影響

在6個(gè)50mL具塞三角瓶中分別加入7.5g、12.0g、13.5 g、14.3 g、14.7 g、15.0 g的奶油，添加水至15 g，所配制得奶油質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為50%、80%、90%、95%、98%和100%。然后分別添加為奶油質(zhì)量的1%的酶量（脂肪酶與復(fù)合蛋白酶比例為2∶1），置于恒溫氣浴振蕩器中開始反應(yīng)（40℃、180 r/min），酶解4 h后置于恒溫水浴鍋中開始滅酶（85℃、30 min），滅酶過(guò)后對(duì)產(chǎn)生的香氣進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，并取其上清液測(cè)定酸價(jià)。

（3）輔助底物對(duì)酶解奶油產(chǎn)香的影響

在2個(gè)50 mL具塞三角瓶中分別加入14.3 g奶油，添加水至15 g，分別添加乳清液與脫脂奶粉3.6 g，然后各添加奶油質(zhì)量1%的酶量（脂肪酶與復(fù)合蛋白酶比例為2∶1），置于恒溫氣浴振蕩器中開始反應(yīng)（40℃、180 r/min），酶解4 h后置于恒溫水浴鍋中開始滅酶（85℃、30 min），滅酶過(guò)后對(duì)產(chǎn)生的香氣進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，并取其上清液測(cè)定酸價(jià)。

（4）乳清液添加量對(duì)酶解奶油產(chǎn)香的影響

在6個(gè)50 mL具塞三角瓶中分別加入奶油14.3 g，水0.7 g，乳清液1.2 g、1.4 g、2.4 g、3.6 g、5.0 g、7.1 g，即乳清液添加量分別為8.4%、9.8%、16.8%、25%、35%、50%，然后各添加奶油質(zhì)量1%的酶量（脂肪酶與復(fù)合蛋白酶比例為2∶1），置于恒溫氣浴振蕩器中開始反應(yīng)（40℃、180 r/min），酶解4 h后置于恒溫水浴鍋中開始滅酶（85℃、30 min），滅酶過(guò)后對(duì)產(chǎn)生的香氣進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，并取其上清液測(cè)定酸價(jià)。

（5）總酶量對(duì)酶解奶油產(chǎn)香的影響

在6個(gè)50 mL具塞三角瓶中分別加入奶油14.3 g、水0.7g、乳清液3.6 g，然后分別添加為奶油質(zhì)量的0.5%、0.8%、1.0%、1.5%、2.0%的酶量（脂肪酶與復(fù)合蛋白酶比例為2∶1），置于恒溫氣浴振蕩器中開始反應(yīng)（40℃、180 r/min），酶解4 h后置于恒溫水浴鍋中開始滅酶（85℃、30 min），滅酶過(guò)后對(duì)產(chǎn)生的香氣進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，并取其上清液測(cè)定酸價(jià)。

（6）脂肪酶和復(fù)合蛋白酶比例對(duì)酶解奶油產(chǎn)香的影響

在6個(gè)50 mL具塞三角瓶中分別加入奶油14.3 g、水0.7 g、乳清液3.6 g，總酶量為奶油的1%（脂肪酶與復(fù)合蛋白酶比例分別為1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1），置于恒溫氣浴振蕩器中開始反應(yīng)（40℃、180 r/min），酶解4 h后置于恒溫水浴鍋中開始滅酶（85℃、30 min），滅酶過(guò)后對(duì)產(chǎn)生的香氣進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，并取其上清液測(cè)定酸價(jià)。

（7）酶解時(shí)間對(duì)酶解奶油產(chǎn)香的影響

在6個(gè)50 mL具塞三角瓶中分別加入奶油14.3 g、水0.7 g、乳清液3.6 g、然后各添加奶油質(zhì)量1%的酶量（脂肪酶與復(fù)合蛋白酶比例為2∶1），置于恒溫氣浴振蕩器中開始反應(yīng)（40℃、180 r/min），分別酶解4 h、6 h、7 h、8 h、13 h后置于恒溫水浴鍋中開始滅酶（85℃、30 min），滅酶過(guò)后對(duì)產(chǎn)生的香氣進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，并取其上清液測(cè)定酸價(jià)。

1.3.5 酸價(jià)測(cè)定

酸價(jià)（以脂肪計(jì)）測(cè)定方法參考GB/T 5530—2005《動(dòng)植物油脂酸值和酸度測(cè)定》。

1.3.6 感官評(píng)價(jià)

由5位感官評(píng)價(jià)成員，根據(jù)各自的喜好對(duì)發(fā)酵所得奶味香精的香氣進(jìn)行香氣強(qiáng)度、香氣協(xié)調(diào)性、留香3個(gè)方面的評(píng)價(jià)，滿分100分，具體的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪酶的篩選

選擇4種脂肪酶lipase A、lipase G、lipase R、lipase AY水解奶油制備天然奶味香基。lipase A主要作用于α位。lipase AY水解甘油三酯的1、2和3位置形成短鏈、中鏈和長(zhǎng)鏈脂肪酸。lipase G主要作用于甘油單酯、甘油二酯，游離出脂肪酸。lipase R主要作用于甘油三酯的α位。除長(zhǎng)鏈外，更能游離出中鏈、短鏈脂肪酸。

不同微生物來(lái)源的脂肪酶由于酶活中心結(jié)構(gòu)的差異，水解相同的甘油三酯所表現(xiàn)出的脂肪酸特異性不同。奶味香氣主要是由低級(jí)脂肪酸、羰基化合物以及極微量的揮發(fā)性成分組成。中短鏈脂肪酸對(duì)奶味香氣直接貢獻(xiàn)較大，是構(gòu)成奶香的直接因素[15]。另外，酶活性越強(qiáng)，酶解就越充分，所得風(fēng)味物質(zhì)就越豐富，不同脂肪酶對(duì)酶解奶油產(chǎn)香的影響見(jiàn)表2。由表2可知，lipase A活力較其他三個(gè)大，且酶解奶油產(chǎn)生的香型是甜香型。選擇lipase A為催化劑，酶解奶油制備甜香型天然奶味香基。

2.2 溫度對(duì)酶解奶油產(chǎn)香的影響

酶類對(duì)溫度比較敏感，溫度過(guò)高會(huì)使脂肪酶變性失活；溫度過(guò)低會(huì)抑制酶的活性，同時(shí)也會(huì)影響底物的黏度，從而影響傳質(zhì)速度。溫度對(duì)酶解奶油產(chǎn)香的影響結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，當(dāng)溫度低于40℃時(shí)，隨著溫度的升高，酸價(jià)和香氣評(píng)分呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，隨著酶活性的增強(qiáng)，香氣濃度也隨之增加；當(dāng)溫度高于40℃時(shí)，隨著溫度的增加，令人不悅的酸臭味加重，奶香變淡。綜合考慮，最適的酶解溫度選擇40℃為宜。

2.3 奶油含量對(duì)酶解奶油產(chǎn)香的影響

適量的水能促進(jìn)酶反應(yīng)，而過(guò)量的水會(huì)使酶反應(yīng)速度下降，導(dǎo)致酶解奶油產(chǎn)香效果變差。奶油含量越大，酶解產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)就越多越豐富，但當(dāng)奶油含量過(guò)大時(shí)，就可能產(chǎn)生一些不需要的風(fēng)味物質(zhì)，使得所產(chǎn)奶味香基香氣不協(xié)調(diào)，帶有異味（如酸味）等。奶油含量對(duì)酶解奶油產(chǎn)香的影響見(jiàn)表4。

由表4可知，當(dāng)奶油含量＜95%時(shí)，奶油含量越高，香氣強(qiáng)度越大，且酸價(jià)也有上升的趨勢(shì)；當(dāng)奶油含量達(dá)到95%時(shí)，所得奶味香基為濃郁、圓潤(rùn)，回味悠長(zhǎng)的香甜型奶味，此時(shí)測(cè)得所產(chǎn)奶味香基的酸價(jià)為18.7 mg/g；當(dāng)奶油濃度＞95%時(shí)，產(chǎn)香效果開始變差，所得奶味香基均帶有酸味，酸價(jià)仍然呈上升趨勢(shì)。綜合考慮，最適的奶油含量選擇95%為宜。

2.4 輔助底物對(duì)酶解奶油產(chǎn)香的影響

以純奶油為底物水解后產(chǎn)物的香氣較為單一，通過(guò)添加輔助底物可以使產(chǎn)物的香氣更加豐富。不同輔助底物水解產(chǎn)物的香氣評(píng)分如表5。

由表5可知，輔助底物為乳清液的香氣最為柔和純正，產(chǎn)品的風(fēng)格豐富。因此，選用乳清液為輔助底物。

2.5 乳清液添加量對(duì)酶解奶油產(chǎn)香的影響

乳清液的添加使得酶解底物更加豐富、柔和，具有修飾奶味香基風(fēng)味的作用，并且使所得奶味香基的口感更加細(xì)膩香滑。乳清液添加量對(duì)酶解奶油產(chǎn)香的影響見(jiàn)表6。

由表6可知，當(dāng)乳清液添加量＜3.6 g時(shí)，隨著乳清液添加量的增加，感官評(píng)價(jià)的分?jǐn)?shù)也越高；當(dāng)乳清液添加量達(dá)到3.6 g時(shí)，所得奶味香基為濃郁、圓潤(rùn)，回味悠長(zhǎng)的香甜型奶味，此時(shí)測(cè)得所產(chǎn)奶味香基酸價(jià)為19.2 mg/g；當(dāng)乳清液添加量＞3.6 g時(shí)，隨著乳清液含量的增加，產(chǎn)香效果越差，焦糖味加重，所得奶味香基的酸價(jià)也隨之呈上升趨勢(shì)。綜合考慮，最適的乳清液添加量選擇3.6 g即25%為宜。

2.6 總酶量對(duì)酶解奶油產(chǎn)香的影響

酶催化生成奶味香基時(shí)，其用量對(duì)香基的風(fēng)味有較大影響。酶用量少時(shí)，風(fēng)味物質(zhì)生成量少，奶味較淡；用量過(guò)多，雖然可以產(chǎn)生大量的風(fēng)味物質(zhì)，但會(huì)引起其它不良現(xiàn)象的產(chǎn)生，如產(chǎn)生異味等，再者也會(huì)增加生產(chǎn)成本。酶添加量對(duì)酶解奶油產(chǎn)香影響的結(jié)果見(jiàn)表7。

由表7可知，當(dāng)總酶量＜1.0%時(shí)，隨著總酶量的增大，產(chǎn)香效果越好，香氣越濃郁，上清液顏色越深且清澈；當(dāng)總酶量為1.0%時(shí)，所得奶味香基為濃郁、圓潤(rùn)且回味悠長(zhǎng)的香甜型奶味，此時(shí)測(cè)得所產(chǎn)奶味香基酸價(jià)為19.7 mg/g；當(dāng)總酶量＞1.0%時(shí)，所得奶味香基開始出現(xiàn)酸敗味，且隨著總酶量的增大，酸敗味越嚴(yán)重，酸價(jià)亦呈上升趨勢(shì)。綜合考慮，最適的總酶量選擇1.0%為宜。

2.7 脂肪酶和復(fù)合蛋白酶比例對(duì)酶解奶油產(chǎn)香的影響

隨著脂肪酶比例的增加，酶解奶油產(chǎn)生的風(fēng)味底物就越多越豐富，原來(lái)的清淡奶香味變成濃郁香醇的奶香味。復(fù)合蛋白酶可同時(shí)對(duì)多種蛋白質(zhì)進(jìn)行水解，使酶解后產(chǎn)生的奶味香基風(fēng)味得到修飾，口感更加細(xì)膩香滑。脂肪酶和復(fù)合蛋白酶比例對(duì)酶解奶油產(chǎn)香的影響結(jié)果見(jiàn)表8。

由表8可知，當(dāng)脂肪酶A與復(fù)合蛋白酶比例＜2∶1時(shí)，隨著脂肪酶A添加量的增大，所得奶味香基的香氣強(qiáng)度也隨之加強(qiáng)，酸價(jià)呈上升趨勢(shì)；當(dāng)脂肪酶A與復(fù)合蛋白酶比例為2∶1時(shí)，所得奶味香基的香氣最濃郁，奶香味與甜味協(xié)調(diào)，自然且留香時(shí)間久，此時(shí)測(cè)得所產(chǎn)奶味香基的酸價(jià)為20.6 mg/g；當(dāng)脂肪酶A與復(fù)合蛋白酶比例＜2∶1時(shí)，隨著脂肪酶A添加量的增大，所得奶味香基的風(fēng)味就越不協(xié)調(diào)，且酸敗味加重，酸價(jià)仍然呈上升趨勢(shì)。綜合考慮，最適的脂肪酶A與復(fù)合蛋白酶比例為2∶1。

2.8 酶解時(shí)間對(duì)酶解奶油產(chǎn)香的影響

從理論上說(shuō)，酶解時(shí)間越長(zhǎng)，酶解就越徹底，實(shí)際上，過(guò)長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間可能會(huì)造成不良風(fēng)味物質(zhì)的生成增多，影響香基的整體風(fēng)味，但如果作用時(shí)間過(guò)短，使得反應(yīng)程度不足，風(fēng)味物質(zhì)生成太少，風(fēng)味沒(méi)有充分形成，所以要達(dá)到理想的風(fēng)味，反應(yīng)時(shí)間應(yīng)控制好。酶解時(shí)間對(duì)酶解奶油產(chǎn)香的影響結(jié)果（表9）可知，當(dāng)酶解時(shí)間＜7 h時(shí)，酶解時(shí)間越長(zhǎng)，所得奶味香基的香氣就越濃郁，酸價(jià)隨之呈上升趨勢(shì)；當(dāng)酶解時(shí)間為7 h時(shí)，產(chǎn)香效果達(dá)到最好，所得奶味香基呈現(xiàn)出濃郁、圓潤(rùn)的奶香氣，并與奶甜味協(xié)調(diào)，留香時(shí)間長(zhǎng)，此時(shí)測(cè)得所產(chǎn)奶味香基的酸價(jià)為21.0 mg/g；酶解時(shí)間＞7 h時(shí)，開始出現(xiàn)酸敗味，且隨著酶解時(shí)間的加長(zhǎng)，酸敗味也隨之加重，酸價(jià)呈上升趨勢(shì)。綜合考慮，最適的酶解時(shí)間選擇7 h為宜。

3 結(jié)論

復(fù)合酶制備天然奶味香基的最適脂肪酶為lipase A，最適酶解溫度為40℃，最適奶油濃度為95%，最適輔助底物為乳清液，最適乳清液添加量為25%，最適總酶量為1.0%，最適脂肪酶與復(fù)合蛋白酶比例為2∶1，最適酶解時(shí)間為7 h。在該最佳反應(yīng)條件下，所產(chǎn)生的奶香風(fēng)味香甜、濃郁、圓潤(rùn)、柔和，此時(shí)所產(chǎn)奶味香基的酸價(jià)在18～21 mg/g之間，感官評(píng)分值可達(dá)到70以上。

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ZHANG Huidan1,WANG Wei1,2*,BAI Weidong1,2,HE Luoqiang3
(1.Light Industry Institute of Food,Zhongkai University of Agriculture and Engineering,Guangzhou 510225,China; 2.Guangdong Engineering Technology Research Center for Lingnan Specialty Food,Guangzhou 510225,China; 3.Guangdong Wincom Flavors&Fragrances Co.,Ltd.,Guangzhou 510000,China)

The natural milky flavor was prepared from cream hydrolyzed by compound enzyme of lipase and protease.Results showed that the optimal reaction temperature,time,cream concentration,compound enzyme addition,whey solution addition,lipase A and protease ratio were 40℃,7 h, 95%,1.0%,25%,2∶1,respectively.The flavor of the prepared natural milky flavor was sweet milky.The acid value was between 18-21 mg/g and the sensory evaluation score of the milky flavor reached over 70.

natural milky flavor;cream;lipase;compound protease;acid value

TS202.3

A

0254-5071（2015）04-0141-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.04.032

2015-03-20

仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院——廣東銘康香精香料有限公司橫向課題（D1141433）

張惠丹（1991-），女，本科生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。

*通訊作者：汪薇（1981-），女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。