陳錦，胡茂豐，文欣，吳章華，劉素純，5*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙410128；3.湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖南長沙410128；4.長沙市調(diào)料食品工程技術(shù)研究中心，湖南長沙410000；5.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙410128）

HPLC測定不同廠家發(fā)酵型茶葉中阿魏酸含量

陳錦1，胡茂豐2，文欣3，吳章華4，劉素純1，5*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙410128；3.湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖南長沙410128；4.長沙市調(diào)料食品工程技術(shù)研究中心，湖南長沙410000；5.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙410128）

采用高效液相色譜法測定不同廠家發(fā)酵型茶葉中阿魏酸的含量，色譜條件為Shimpack VP-ODS C18（150 mm×6 mm，5 μm）色譜柱，流動(dòng)相為0.2%冰醋酸-甲醇（28∶72），檢測波長314 nm，柱溫30℃，流速1.0 mL/min。結(jié)果表明，阿魏酸在20～100 μg/mL范圍內(nèi)線性良好（相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8），平均加樣回收率為98.73%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.71%。測得9個(gè)廠家不同發(fā)酵型茶葉中阿魏酸的含量在22.559～30.286 μg/g，其中湖南益陽的湘益茯磚茶阿魏酸含量最高，為30.286 μg/g。該方法簡便快速，適用于發(fā)酵型茶葉中阿魏酸含量的測定。

阿魏酸含量；發(fā)酵型茶；高效液相色譜；檢測條件

發(fā)酵型茶是中國傳統(tǒng)茶類之一，生產(chǎn)歷史悠久，早在11世紀(jì)前后就有有關(guān)于茶蒸制成團(tuán)塊，堆積20多天使其變色的記載，因其獨(dú)特的品質(zhì)風(fēng)味，深受人們喜愛。微生物在其渥堆過程中起到關(guān)鍵作用，GREENWALT C J等[1]研究表明，經(jīng)微生物發(fā)酵后的茶比綠茶具有更高的生物活性，這種活性主要來源于酚酸類物質(zhì)。阿魏酸是桂皮酸的衍生物，是普遍存在的一種酚酸，具有抗氧化[2]、抗血栓[3]、降血脂[4]、抗菌消炎[5]以及抗突變防癌[6]等功能。其含量測定方法的報(bào)道有很多，主要有氣相色譜法[7]、薄層顯色掃描法[8]、紫外分光光度法[9]及高效液相色譜法[10]。但目前，國內(nèi)外大多研究集中在茶葉中沒食子酸[11]、原兒茶酸[12]、咖啡酸[13]、蘆丁[14]等，少見發(fā)酵型茶中阿魏酸含量測定的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)就提高阿魏酸的穩(wěn)定性及高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法測定阿魏酸含量的方法進(jìn)行了探討，并用HPLC法測定了不同廠家生產(chǎn)的不同的幾種典型發(fā)酵型茶中阿魏酸的含量，并進(jìn)行比較分析，為發(fā)酵型茶葉中阿魏酸含量的質(zhì)量控制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶葉樣品為市場購買的黑毛茶，中藥粉碎機(jī)粉碎過100目篩后備用；茯磚茶、普洱茶、青磚茶3種茶葉各選3個(gè)不同茶廠生產(chǎn)的產(chǎn)品作為測定的樣品，中藥粉碎機(jī)粉碎過100目篩后，備用。

甲醇（色譜純）、冰醋酸（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水為超純水；其他試劑均為國產(chǎn)分析純；阿魏酸標(biāo)樣：上海紫一試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters 2695高效液相色譜儀、Waters 2996二級(jí)管陣列檢測器、Empower色譜工作站：美國Waters公司；FW135中藥粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；BCD-206BD電冰箱：青島海爾有限公司；TE214S分析天平：長沙康源科技開發(fā)有限公司；CF-RXⅡ離心機(jī)：日本日立公司；pHS-3E pH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；SB120D超聲波清洗機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備

稱取茶葉樣品粉末（過100目篩）約0.2 g，于10 mL容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇加至刻度，超聲（40 kHz、120 W）提取30 min，靜置。取上清液過0.45 μm濾膜，取濾液進(jìn)樣。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

稱取阿魏酸對(duì)照樣品1 mg于250 mL棕色容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇加至刻度，超聲（40 kHz、120 W）提取30 min，靜置。取上清液過0.45 μm濾膜，取濾液進(jìn)樣。

1.3.3 色譜條件

Shimpack VP-ODS C18（150 mm×6 mm，5 μm）色譜柱，流動(dòng)相選用0.2%冰醋酸-甲醇（28∶72）[11]，流速1mL/min，檢測波長314 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 測定條件的選擇

文獻(xiàn)報(bào)道中高效液相色譜法測定阿魏酸含量多用體積分?jǐn)?shù)為70%、50%的甲醇、體積分?jǐn)?shù)為70%、50%的乙醇等作為溶劑[11]，樣品制備方法的篩選中，對(duì)比了4種溶劑對(duì)樣品中阿魏酸的提取，結(jié)果用體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇提出的阿魏酸最為完全，因此確定用體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇作溶劑，但因阿魏酸不穩(wěn)定，容易分解，對(duì)照品溶液及樣品溶液配制后，應(yīng)存放于棕色試劑瓶中避光低溫保存，且須當(dāng)天配制。阿魏酸對(duì)照品溶液在190～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描，結(jié)果表明，阿魏酸在波長314 nm處吸收靈敏度最高，因此選用314 nm為檢測波長。

2.2 阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及含量測定

標(biāo)品及樣品高效液相色譜圖見圖1。吸取質(zhì)量濃度分別為20 μg/mL、40 μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL對(duì)照品溶液進(jìn)行色譜測定，按上述色譜條件測定峰面積，以阿魏酸含量（x）對(duì)峰面積（y）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2，得回歸方程：y=0.727x+0.019 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8。結(jié)果表明，阿魏酸質(zhì)量濃度在20～100 μg/mL間與峰面積有良好的線性關(guān)系[16]。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn)

按照樣品測定方法，精密吸取上述阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，每次進(jìn)樣量10 μL，結(jié)果（見表1）可知，檢測結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為1.46%，＜5%，表明儀器精密度良好[16]。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取茶葉樣品（過100目篩）約2.0 g（6份），按1.3.1制備樣品溶液，測定阿魏酸含量，結(jié)果見表2。由表2可知，檢測結(jié)果RSD為1.67%，＜5%，表明該檢測方法重現(xiàn)性好[16]。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一樣品溶液，進(jìn)樣量10 μL，分別測定阿魏酸的含量，結(jié)果見表3。由表3可知，檢測結(jié)果RSD為1.59%，＜5%，表明樣品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 加樣回收率試驗(yàn)

取茶葉樣品約0.1 g共6份，于10 mL容量瓶中，加入阿魏酸對(duì)照品20 μg，加體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇至刻度，超聲30 min靜置，取上清液過0.45 μm濾膜，取濾液，進(jìn)樣10 μL，按上述色譜條件測定阿魏酸含量，分別計(jì)算回收率，結(jié)果見表4。

由表4可知，檢測結(jié)果所得平均回收率為98.73%，RSD=1.71%，＜5%，表明該方法準(zhǔn)確度高。

2.3.5 樣品提取的條件選擇

稱取樣品茶葉粉末（過100目篩）約0.4 g于10 mL棕色容量瓶中（3份），用體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇稀釋至刻度，分別超聲（40 kHz，120 W）提取10 min、20 min、30 min，靜置。取上清液過0.45 μm濾膜，取濾液，色譜檢測條件下進(jìn)樣10 μL，檢測阿魏酸含量，結(jié)果見表5。

由表5可知，超聲提取10 min未將阿魏酸提取充分，超聲提取20 min較好，與30 min含量沒有明顯變化，因此，選用超聲提取20 min。

2.4 樣品中阿魏酸含量的測定

不同茶廠具有各自獨(dú)立的生產(chǎn)線與發(fā)酵環(huán)境，同一廠家的茶類產(chǎn)品成分大致相近，因此本研究選擇不同茶廠較具代表性的一種發(fā)酵型茶葉產(chǎn)品作為研究對(duì)象。茯磚茶、青磚茶、普洱茶3種茶葉各選3個(gè)不同茶廠生產(chǎn)的產(chǎn)品作為測定的樣品，中藥粉碎機(jī)粉碎過100目篩后，備用。每個(gè)樣品取2.0 g左右，按1.3.1制備樣品溶液，進(jìn)樣10 μL，檢測阿魏酸含量，結(jié)果見表6。

由表6可知，產(chǎn)于湖南益陽的茯磚茶，阿魏酸含量最高30.286 μg/g，產(chǎn)于云南的普洱茶阿魏酸含量略低為25.762 μg/g，產(chǎn)于湖北的青磚茶阿魏酸含量最低為22.559 μg/g，其含量比湖南益陽的茯磚茶低25.3%，可見不同產(chǎn)地廠家的發(fā)酵型茶葉中阿魏酸的含量差異很大，可能是由原料及制備工藝的差異引起的。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)確定了發(fā)酵型茶葉中阿魏酸的HPLC最佳檢測條件為Shimpack VP-ODS C18色譜柱（150 mm×6 mm，5μm），流動(dòng)相選用0.2%冰醋酸-甲醇（28∶72）[11]，流速1 mL/min，檢測波長314 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣10 μL。并在上述條件下進(jìn)行了儀器精密度試驗(yàn)RSD=1.46%、重復(fù)性試驗(yàn)RSD=1.67%、穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD=1.59%、加樣回收率試驗(yàn)RSD=1.71%，均證明試驗(yàn)的可行性良好。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行測定各個(gè)地區(qū)不同廠家發(fā)酵型茶的茶葉樣品中阿魏酸的含量，測定結(jié)果表明產(chǎn)于湖南益陽的茯磚茶阿魏酸含量最高為30.286 μg/g，不同產(chǎn)地廠家的發(fā)酵型茶葉中阿魏酸的含量差異很大，可能是由原料及制備工藝的差異引起的，具體原因有待進(jìn)一步探討。對(duì)不同產(chǎn)地不同差價(jià)的發(fā)酵型茶葉中阿魏酸的含量進(jìn)行比較對(duì)完善發(fā)酵型茶葉的質(zhì)控體系具有重要意義，茶葉中阿魏酸的具體含量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)有待進(jìn)一步研究。

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CHEN Jin1,HU Maofeng2,WEN Xin3,WU Zhanghua4,LIU Suchun1,5*
(1.College of Food Science and Technology,Hunan Agricultural University,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China; 2.College of Bioscience and Biotechnology,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China; 3.Hunan Institute of Food Quality Supervision Inspection and Research,Changsha 410128,China; 4.Changsha Seasoning Food Engineering Technology Research Center,Changsha 410000,China; 5.Hunan Key Laboratories of Food Science and Biotechnology,Changsha 410128,China)

The ferulic acid contents of fermented tea from different manufacturers were determined by HPLC.The separation was performed on Shimpack VP-ODS C18column(150 mm×6 mm,5 μm)with 0.2%glacial acetic acid-methyl alcohol(28∶72)as mobile phase.Ferulic acid was detected at 314 nm with flowing rate 1.0 ml/min at 30℃.The calibration curve was linear(R2=0.999 8)in the range of 20-100 μg/ml for ferulic acid.The average recovery was 98.73%and relative standard deviation was 1.71%,respectively.The ferulic acid contents of fermented tea from 9 manufacturers were 22.559-30.286 μg/g,and the ferulic acid content in Xiangyi brick tea was the highest of 30.286 μg/g.The method was quick and convenient for ferulic acid determination for fermented tea.

ferulic acid content;fermented tea;HPLC;determination conditions

O657.7

A

0254-5071（2015）04-0161-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.04.037

2015-03-17

湖南省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012NK3072）

陳錦（1989-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)闋I養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)。

*通訊作者：劉素純（1966-），女，博士，教授，研究方向?yàn)闋I養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)。