何敏恒，李秀英，曾令浩，黃景晟，郭新東*

（廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院國家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心（廣州），廣東廣州511447）

同位素稀釋-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測蜂蜜中泛酸含量

何敏恒，李秀英，曾令浩，黃景晟，郭新東*

（廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院國家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心（廣州），廣東廣州511447）

建立了同位素稀釋-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）檢測蜂蜜中泛酸（維生素B5）的快速定量和確證方法。樣品經(jīng)0.1%氨水（V/V）提取，MAX固相萃取柱凈化后，以0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水為流動相梯度洗脫，使用HSS T3色譜柱進(jìn)行分離，電噴霧正離子多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式檢測，同位素內(nèi)標(biāo)法定量。在優(yōu)化條件下，泛酸在0.500～500 μg/L范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.999 6；方法檢出限為1.0 μg/kg（S/N=3），定量限為3.0 μg/kg（S/N=10）；回收率在98.3%～98.7%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.4%～3.1%。通過市售蜂蜜樣品測試表明，該方法操作簡單、檢測結(jié)果準(zhǔn)確，可用于蜂蜜中泛酸的快速檢測。

蜂蜜；泛酸；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；同位素稀釋

蜂蜜是主要的蜂產(chǎn)品，是人類最早的食物來源之一，目前幾乎每個國家都有生產(chǎn)。它的主要成分為果糖和葡萄糖[1]，此外還含有種類豐富的微量元素及多酚，黃酮，有機(jī)酸，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，呋喃醛和呋喃酸，氨基酸和蛋白質(zhì)，礦物質(zhì)和水溶性維生素。蜂蜜中微量元素的定性和定量的特征與其物理、化學(xué)及生物特性一樣，能夠成為追溯其植物來源和地理來源的一個有力的工具。因此，近年來對這些微量元素的檢測分析方法研究的發(fā)展吸引了越來越多的關(guān)注。

泛酸也稱維生素B5，是B族維生素的一種，是蜂蜜中一種常見的微量元素。泛酸是構(gòu)成輔酶A的重要成分，在維持細(xì)胞的代謝，維護(hù)頭發(fā)、血液、皮膚等的健康方面起著重要作用，泛酸缺乏可導(dǎo)致機(jī)體代謝混亂[2]。

目前泛酸的檢測方法有紫外分光光度法[3]，高效液相色譜法[4-7]，氣質(zhì)聯(lián)用法[8]，微生物法[9-11]，液質(zhì)聯(lián)用法[12-13]，生物傳感器法[14-15]，檢測對象多為乳粉和保健食品，由于紫外分光光度法、高效液相色譜法無法滿足確證要求；氣質(zhì)聯(lián)用法需要衍生，操作較繁瑣；微生物法步驟較多，分析時間較長；生物傳感器法還處于研究階段，未能成為日常檢驗的方法；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（ultra performance liquidchromatographytandemmassspectrometry，UPLC-MS/ MS）采用保留時間與特征離子對比例對已知目標(biāo)物進(jìn)行分析，檢測結(jié)果的定性定量優(yōu)勢明顯。本研究通過在樣品中添加同位素內(nèi)標(biāo)，建立了一種簡單、快速、準(zhǔn)確的蜂蜜中泛酸含量分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

泛酸鈣（純度≥98.0%）：德國Dr Ehrenstorfer GmbH公司；泛酸鈣-[13C6，15N2]（泛酸鈣同位素內(nèi)標(biāo)，純度≥99.5%）：美國IsoSciences公司；氨水（分析純）：廣州化學(xué)試劑廠；甲酸（色譜純）：上海安譜科學(xué)儀器有限公司；乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）：美國Merck公司；實驗用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 6490超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Agilent公司；Acquity＠HSS T3色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）、Waters Oasis MAX固相萃取柱（60 mg，3 mL）：美國Waters公司；BSA224S電子天平：德國Sartorius公司；MS3 basic渦旋振蕩儀：德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液：用超純水分別將泛酸鈣，泛酸鈣-[13C6，15N2]標(biāo)準(zhǔn)品配制成100 μg/mL（以泛酸計）儲備液，4℃保存。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：用超純水分別將泛酸鈣標(biāo)準(zhǔn)儲備液，泛酸鈣-[13C6，15N2]標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋至5.0 μg/mL，4℃保存。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：用超純水將標(biāo)準(zhǔn)工作液分別配制成泛酸質(zhì)量濃度為0.500μg/L、5.00μg/L、10.0μg/L、40.0μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L，同位素內(nèi)標(biāo)（泛酸鈣-[13C6，15N2]）質(zhì)量濃度為100 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2 樣品處理方法

樣品提取：稱取2.5 g蜂蜜（準(zhǔn)確至0.01 g）試樣于10 mL比色管中，加入同位素內(nèi)標(biāo)工作液100 μL，加入5 mL 0.1%氨水溶液（V/V），渦旋充分溶解，用0.1%氨水溶液（V/V）定容至10 mL，渦旋提取2 min，待凈化。

樣品凈化：取2 mL待凈化液至Waters Oasis MAX小柱中（預(yù)先用5 mL甲醇，5 mL 0.1%氨水溶液（V/V）活化），依次用6 mL水、6 mL甲醇淋洗，棄去流出液，最后用3 mL 2%甲酸甲醇（V/V）洗脫，收集洗脫液，50℃水浴中氮吹濃縮至近干，用超純水定容至1 mL，渦旋振蕩溶解，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后供UPLC-MS/MS測定。

1.3.3 儀器條件

色譜條件：色譜柱Waters HSS T3柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；流速0.45 mL/min；柱溫30℃；進(jìn)樣量2 μL；流動相A 0.1%甲酸溶液（V/V）；流動相B：0.1%甲酸乙腈（V/V）；梯度洗脫：0～2.2 min，92%～80%A；2.2～2.4 min，80%～50%A；2.4～4.0 min，50%A；4.0～4.1 min，50%～92%A；4.1～7.0 min，92%A。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源；正離子模式；多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式；毛細(xì)管電壓1.5 kV；離子源氣溫150℃；鞘氣流量（氮氣）11 L/min；鞘氣溫度250℃；毛細(xì)管電壓3 000 V。泛酸及泛酸同位素內(nèi)標(biāo)的定量和定性離子對、碰撞池加速電壓、碰撞能量等參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理條件的優(yōu)化

2.1.1 固相萃取柱的選擇

蜂蜜成分復(fù)雜，其中糖類物質(zhì)占60%以上，此外還有花粉、色素、蠟質(zhì)等雜質(zhì)。在質(zhì)譜分析中，為了減少基質(zhì)效應(yīng)，樣品前處理時需要盡量去除這些雜質(zhì)，否則不僅會影響泛酸分析的準(zhǔn)確性，還會影響質(zhì)譜儀的壽命。固相萃取是一種有效從復(fù)雜基質(zhì)中提取目標(biāo)分析物，減少基質(zhì)效應(yīng)的凈化手段。本實驗比較了Waters Oasis C18（60 mg，3 mL）、WatersOasisHLB（60mg，3mL）、WatersOasisMAX（60mg，3 mL）三種固相萃取柱對蜂蜜中泛酸的凈化效果，結(jié)果見表2。

通過對上樣流出液、淋洗液和洗脫液的分析，Waters Oasis HLB對泛酸的保留性不強(qiáng)，在上樣的過程中就有部分的泛酸流出；Waters Oasis C18對泛酸的保留性較強(qiáng)，但在淋洗過程中仍有少量泛酸被洗脫；Waters Oasis MAX的效果最好，Waters Oasis MAX是陰離子型固相萃取柱，由于泛酸的酸度系數(shù)（pKa）值為4.41[16]，而糖類物質(zhì)的pKa值在12～14之間，通過調(diào)節(jié)上樣液的pH值，可使泛酸選擇性吸附在固相萃取柱上，并將糖類物質(zhì)通過淋洗去除。經(jīng)凈化后，在色譜圖上未發(fā)現(xiàn)明顯的雜峰，由表2可知，泛酸的回收率為95.3%～101.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為3.3%～7.1%，因此選擇Waters Oasis MAX進(jìn)行凈化。

2.1.2 提取液的選擇

蜂蜜中含有有機(jī)酸，因此蜂蜜的水溶液呈酸性，泛酸的pKa值為4.41，使用Waters Oasis MAX固相萃取柱要求上樣溶液的pH值比泛酸的pKa值大2個單位，因此需要調(diào)節(jié)蜂蜜溶液的pH值，使其大于6.41?？疾炝朔涿墼诩兯?、0.1%、0.5%、1.0%、2.0%、5.0%氨水溶液（V/V）作為提取液時的回收率，結(jié)果見表3。由表3可知，用純水提取時，回收率為62.3%，而提取液中氨水體積分?jǐn)?shù)≥0.1%時，溶液的pH值均＞9.5，回收率均≥97.5%，因此選擇0.1%氨水作為提取液。

2.1.3 固相萃取上樣體積的優(yōu)化

固相萃取柱隨著上樣體積的增加，會出現(xiàn)過載的現(xiàn)象，從而影響回收率。分別取的待凈化液0.5mL、1.0mL、2.0mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL進(jìn)行測試，考察蜂蜜在Waters Oasis MAX（60 mg，3 mL）柱上的最優(yōu)上樣體積，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，固相萃取柱在上樣體積＞2.0 mL時過載，而上樣體積越大，方法的檢出限越低，因此上樣體積選擇2.0 mL。

2.2 儀器條件的優(yōu)化

泛酸的極性較強(qiáng)，難以在常規(guī)的C18色譜柱上保留。本實驗選用了對極性化合物有較強(qiáng)保留的Waters HSS T3色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖2。由圖2可知，泛酸在Waters HSS T3色譜柱上有較好的保留，且峰型對稱，峰寬為0.3 min。在正離子模式下，在流動相中加入0.1%甲酸有利于泛酸形成[M+H]+分子離子峰，還可以維持流動相在梯度變化時流動相體系的pH平衡。

2.3 方法的驗證

2.3.1 線性關(guān)系和方法檢出限

在優(yōu)化條件下，對泛酸的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液（含有100 μg/L同位素內(nèi)標(biāo)）進(jìn)行檢測，記錄定量離子峰面積（A）和內(nèi)標(biāo)的色譜峰面積（Ai），以A和Ai的比值（y）對泛酸質(zhì)量濃度（x，μg/L）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖3。

對泛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行回歸分析，由圖3可知，泛酸在0.500～500 μg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為y=0.031 9x-0.055 9，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 6。根據(jù)儀器的檢出限及定量限，計算得到方法檢出限（定量離子S/N=3）和方法定量限（定量離子S/N=10）分別為1.0 μg/kg和3.0 μg/kg。

2.3.2 方法回收率和精密度

取蜂蜜樣品，分別添加40.0μg/kg、80.0μg/kg、160.0μg/kg 3個水平的泛酸，按1.3的方法進(jìn)行檢測，每個添加水平平行測定6次。泛酸的回收率和精密度見表4。由表4可知，3個添加水平的平均加標(biāo)回收率為98.3%～98.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.4%～3.1%。結(jié)果表明，在3個加標(biāo)水平下，泛酸檢測準(zhǔn)確度、精密度良好，可以滿足蜂蜜中泛酸檢測的要求。

2.3.3 實際樣品檢測

使用本方法檢測了10個市售蜂蜜樣品的泛酸含量，結(jié)果表明10個樣品均檢出泛酸，含量為84.1～361.0 μg/kg。目前現(xiàn)行的國標(biāo)GB/T 22246—2008《保健食品中泛酸鈣的測定》檢出限為2 000 μg/kg，GB/T 5009.210—2008《食品中泛酸的測定》檢出限為2 500 μg/kg，靈敏度均無法滿足蜂蜜中泛酸檢測的要求，本方法的檢出限和定量限分別為1.0μg/kg和3.0μg/kg，可滿足蜂蜜中泛酸含量檢測的要求。

3 結(jié)論

本研究建立了使用同位素稀釋-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定蜂蜜中泛酸的快速檢測及確證方法。本方法利用0.1%氨水進(jìn)行提取，Waters Oasis MAX固相萃取柱凈化，Waters HSS T3色譜柱分離，多反應(yīng)檢測（MRM）模式檢測，內(nèi)標(biāo)法定量。對比現(xiàn)行國標(biāo)泛酸檢測方法，本方法靈敏度高，定性定量準(zhǔn)確，操作簡單，可以用于蜂蜜中泛酸含量的檢測。

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HE Minheng,LI Xiuying,ZENG Linghao,HUANG Jingsheng,GUO Xindong*
(Guangzhou Quality Supervision and Testing Institute,National Centre for Quality Supervision and Testing of Processed Food(Guangzhou),Guangzhou 511447,China)

A method for rapid quantification of pantothenic acid(PA)in honey by isotope dilution-ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS)was developed.The sample was extracted by 0.1%ammonia water(V/V),cleaned-up on Oasis MAX solid-phase extraction column,and finally separated by UPLC using a HSS T3 column,employing acetonitrile with 0.1%formic acid-0.1%formic as the mobile phase for gradient elution.The results were determined by tandem mass spectrometry with multiple reactions monitoring mode and quantified by internal standard method.The result indicated that the linear range was 0.500-500 μg/L,with the correlation coefficients of 0.999 6,the limits of detection(LOD,S/N=3)was 1.0 μg/kg,limits of quantification(LOQ,S/N=10)was 3.0 μg/kg,and the recovery rate ranged from 98.3%to 98.7%with RSD of 2.4%-3.1%(n=6).The sample testing results showed that the method was simple and accurate,and suitable for the determination of PA in honey.

honey;pantothenic acid;UPLC-MS/MS;isotope dilution

O657.6

A

0254-5071（2015）04-0157-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.04.036

2015-03-20

國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局科技計劃項目（2014QK052）

何敏恒（1984-），男，工程師，碩士，研究方向為食品及食品相關(guān)產(chǎn)品分析技術(shù)。

*通訊作者：郭新東（1976-），男，教授級高級工程師，博士，研究方向為色譜質(zhì)譜分析技術(shù)研究。