毛露甜，謝山麟玉，黃 雁，宋冠華，陳勇智，李 盼

（惠州學(xué)院 生命科學(xué)系，廣東 惠州 516000）

目前國內(nèi)肥料應(yīng)用方面存在問題，表現(xiàn)為肥料使用結(jié)構(gòu)不合理，重化肥，輕有機(jī)肥和微生物肥料。尤其是長期不合理大量使用化肥導(dǎo)致諸如土壤肥力下降甚至退化以及作物抗病能力下降等問題［1］?；实氖褂昧孔畲笫堑?，由于施用技術(shù)粗放，甚少配方施肥，產(chǎn)能過剩達(dá)40%，導(dǎo)致農(nóng)產(chǎn)品硝酸鹽含量過高，不符合發(fā)展生態(tài)農(nóng)業(yè)的要求，也無法實(shí)現(xiàn)有機(jī)種植［2，3］。

雖然國家提倡多使用有機(jī)肥，一定程度上緩解了土壤污染問題和農(nóng)作物品質(zhì)問題，但有機(jī)肥不能改善土壤環(huán)境。在此背景下研發(fā)既能提高土壤肥力又能修復(fù)土壤生態(tài)系統(tǒng)的微生物肥料顯得尤為必要，符合綠色種植的時代需求［4］。

微生物肥料又稱菌肥，由功能菌與一定載體混合而制成，利用微生物自身的生命活動產(chǎn)生促進(jìn)作物生長的物質(zhì)，或?qū)⑼寥乐须y溶的礦物質(zhì)轉(zhuǎn)化為作物可以利用的物質(zhì)，從而增加肥效，或誘導(dǎo)作物抗病相關(guān)酶的活性，提高作物抗病力［5］。按作用機(jī)理分，微生物肥料包括固氮菌肥（如自生固氮菌和聯(lián)合固氮菌等），分解難溶礦物質(zhì)菌肥（如解鉀菌和解磷菌），生防菌肥（如枯草芽孢桿菌）等。其中固氮菌肥是最清潔、最經(jīng)濟(jì)的氮肥，不僅能降低環(huán)境污染，還能修復(fù)土壤生態(tài)環(huán)境，是發(fā)展可持續(xù)生態(tài)農(nóng)業(yè)種植的需要。

微生物肥料多以雞糞等經(jīng)腐熟的有機(jī)肥為載體，實(shí)現(xiàn)了將農(nóng)家肥轉(zhuǎn)化為微生物肥料，降低了環(huán)境污染，或用甘蔗渣、椰子皮堆漚處理作載體，變廢為寶，都值得提倡［6］?；葜萦卸嗉乙?guī)?；a(chǎn)食用菌的工廠，其下腳料菌糠多被當(dāng)作廢物丟棄，既浪費(fèi)資源又污染環(huán)境，如何合理利用菌糠變廢為寶成了一個重要的研究課題［7］。

本課題篩選高效固氮菌，用栽培金針菇的下腳料——菌糠為載體，接種固氮菌制備固氮菌肥，以菠菜、小白菜和空心菜為材料，從發(fā)芽率、株高、葉綠素含量、Vc含量等指標(biāo)探討固氮菌肥的肥效，以期為蔬菜綠色種植開發(fā)一種高效穩(wěn)定價廉的微生物肥料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

菌株固氮芽孢菌（Azotobacter vinelandii），由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保種。

菌糠由惠州富力達(dá)農(nóng)業(yè)科技公司提供。

試驗(yàn)用地惠州學(xué)院3號樓旁的空地，翻土三次改良成菜地。

培養(yǎng)基及試劑：①LB 培養(yǎng)基；②Ashby 無氮培養(yǎng)基：甘露醇10.0 g、CaCO35.0 g、KH2PO40.2 g、MgSO4.7H2O 0.2 g、NaCl 0.2 g、CaSO4.2H2O 0.2g；（固體）瓊脂15.0 g；蒸餾水1000 mL。上述培養(yǎng)基均用1 mol/l NaOH 和1 mol/l HCl調(diào)節(jié)pH至7.0-7.2，液體培養(yǎng)基不加瓊脂，121℃滅菌30 min后備用。其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 載體的處理與微生物肥料制作

菌糠的處理 自然風(fēng)干，粉碎，經(jīng)紫外燈照射1 h。放置在干燥處保存?zhèn)溆谩?/p>

固氮菌肥的制作 用Ashby 無氮培養(yǎng)基對固氮菌進(jìn)行分離純化，擴(kuò)大培養(yǎng)采用LB 液體培養(yǎng)基。在恒溫?fù)u床28℃150r/min振蕩培養(yǎng)到對數(shù)期，菌懸液在600 nm波長下測定OD 值（OD值＞0.5可認(rèn)為活菌數(shù)＞108cfu/ml），按菌液：菌糠：無菌水為1:10:10的比例進(jìn)行混勻，加薄膜覆蓋，扎若干透氣孔，約28 ℃堆肥4d使肥料腐熟，制備好的菌肥避光常溫保存于陰涼處。

1.2.2 方法

（1）固氮菌肥各項(xiàng)指標(biāo)檢測

有效活菌數(shù)和雜菌率的測定按照復(fù)合微生物肥料（NY/T798 2004）中5.3.2的規(guī)定進(jìn)行［8］。除樣品有效菌外，其他菌均為雜菌（包括霉菌）。雜菌率=雜菌數(shù)/（雜菌數(shù)+有效活菌數(shù)）×100%。

（2）固氮菌肥肥效測試

發(fā)芽率的測定

將菌肥與無菌水按照1∶10的比例混合，200 r/min振蕩浸提1 h，靜置澄清后，將浸提液稀釋制成不同體積分?jǐn)?shù)（浸提液體積/稀釋后體積），分別為100%、75%、50%和25%。將小白菜種子置于培養(yǎng)皿中，每份25粒，加入不同濃度的浸提液8mL。以無菌水為對照，每皿2個重復(fù)，于20 ℃暗培養(yǎng)進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)。分別在第3 d、4 d、5 d、6 d、7 d計數(shù)發(fā)芽種子數(shù)，計算發(fā)芽率。種子發(fā)芽率=發(fā)芽的種子數(shù)/供檢測的種子數(shù)*100%。

蔬菜生長指標(biāo)測量

取菠菜和空心菜為材料，肥效試驗(yàn)分3個處理組：施固氮菌肥、施菌糠和空白對照，施肥方式選用溝施，即在植株間挖溝添肥再覆土，施用量約為500 g。相同條件澆水。每個處理組種植蔬菜50株，隨機(jī)選取10株分別測定株高、葉綠素含量和Vc含量。

株高：從定植起每隔5d測量一次，每塊地選取10株測量取平均值即為株高。

葉綠素含量測定：取鮮綠葉片用雙蒸水洗凈吸干，去除葉脈，隨機(jī)取樣，準(zhǔn)確稱取0.50g放入研缽中，加入丙酮5 mL，少許CaCO3和石英砂，研磨成均質(zhì)。用丙酮重復(fù)洗兩次研缽合并過濾，用丙酮定容濾液至20mL。以分光光度計分別測定663 nm、645 nm波長處吸光值，以丙酮做對照。計算葉綠素a、葉綠素b的含量和葉綠素總含量。

維生素C含量測定：參照文獻(xiàn)用2，6-二氯靛酚滴定法［9］，略有改動。準(zhǔn)確配制1 mg/ml抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，標(biāo)定2，6-二氯酚靛酚溶液至桃紅色且15s內(nèi)不褪色即為終點(diǎn)。

稱取新鮮菜葉5.0 g，放入研缽中加少許2%草酸研磨至勻質(zhì)，過濾成樣品液。用標(biāo)定過的2，6-二氯靛酚染液滴定至桃紅色且15s不褪色為止，記下染液用量，重復(fù)3次，并以2%草酸做空白滴定對照。按公式計算維生素C含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 固氮菌肥各項(xiàng)指標(biāo)檢測結(jié)果

根據(jù)中國農(nóng)業(yè)部頒布的復(fù)合微生物肥料（NY/T 798-2004）標(biāo)準(zhǔn)，顆粒微生物肥料需要符合以下技術(shù)要求，有效活菌數(shù)≥0.20億/g，雜菌率≤30.0%，水分≤20.0%，pH值5.0-8.0。菌肥指標(biāo)測量結(jié)果見表1?？芍痰试谟行Щ罹鷶?shù)、雜菌率和pH值上都符合要求，水分含量21.3%，與標(biāo)準(zhǔn)水分20%相差不大，可認(rèn)為本實(shí)驗(yàn)制備的固氮菌肥基本符合微生物肥料的技術(shù)要求。

表1 自制固氮菌肥與復(fù)合微生物肥料（NY/T 798-2004）的符合度

2.2 固氮菌肥對小白菜種子發(fā)芽率的影響

種子發(fā)芽率可有效地評價肥料浸提液對植物生長有促進(jìn)作用還是毒害作用。用小白菜的種子進(jìn)行了發(fā)芽試驗(yàn)，由表2可見，浸提液濃度為25%時發(fā)芽率高于空白對照組，顯示低濃度浸提液對種子發(fā)芽有促進(jìn)作用。而較高濃度（75%、100%）時發(fā)芽率低于空白對照組，提示浸提液對種子有毒副作用。濃度為50%時發(fā)芽率與對照組差別不大，可能是促生作用與毒害作用相抵消的緣故。

表2 固氮菌肥不同濃度浸提液對小白菜種子發(fā)芽率的影響（n=25）

2.3 固氮菌肥對蔬菜生長的影響

2.3.1 固氮菌肥對菠菜和空心菜株高的影響

對菠菜和空心菜的株高測量結(jié)果分別見圖1和圖2。圖1可見前10 d 3個處理組的菠菜株高差異不大，第15 d開始3個處理組的株高差異逐漸增大，施肥后第30 d差異明顯，菌肥組的株高比菌糠組和對照組分別平均提高了16.1%和49.3%，且P≤0.05，差異達(dá)顯著水平。圖2可見前15 d 3個處理組的空心菜株高差異不大，第20d開始3個處理組的株高差異逐漸增大，施肥后第30 d差異明顯，菌肥組的株高比菌糠組和對照組分別平均提高了31.2%和49.4%，且P≤0.05，組間差異達(dá)顯著水平。

圖1 不同處理對菠菜株高的影響（n=10）

圖2 不同處理對空心菜株高的影響（n=10）

2.3.2 固氮菌肥對菠菜和空心菜的葉綠素含量的影響

葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的主要色素，是反映葉片生理活性變化的重要指標(biāo)之一。由表3、4可知，施用固氮菌肥后菠菜和空心菜葉片葉綠素含量比菌糠組和對照組高，其中菌肥組的菠菜葉片葉綠素總含量比菌糠組和對照組分別提高了28.3%和34.5%，菌肥組的空心菜葉片葉綠素總含量比菌糠組和對照組分別提高了31.9%和45.7%。

表3 不同處理對菠菜葉綠素含量的影響（n=10）

表4 不同處理對空心菜葉綠素含量的影響（n=10）

2.3.3 施用固氮菌肥對菠菜和空心菜Vc含量的影響

3種處理對菠菜和空心菜Vc含量的測定結(jié)果見表5?？梢娋式M菠菜Vc含量遠(yuǎn)高于菌糠組和對照組，分別為22.8%和38.2%。菌肥組空心菜的Vc含量亦遠(yuǎn)高于菌糠組和對照組，分別為15.3%和35.9%。

表5 不同處理對菠菜和空心菜的Vc含量的影響（n=10）

3 討論

固氮菌肥的施用對作物的反應(yīng)表現(xiàn)在生理、產(chǎn)量、品質(zhì)、表觀形態(tài)等諸多方面。因而，不能采用單一指標(biāo)來評價，只有通過對多項(xiàng)指標(biāo)的綜合評價，才能客觀地反映出固氮菌肥對作物的施用效果［10］。本試驗(yàn)選用反映蔬菜生長發(fā)育的株高、葉綠素含量指標(biāo)，以及反映蔬菜品質(zhì)的Vc含量等多個指標(biāo)，以期綜合評定固氮菌肥對蔬菜種植的肥效。

從結(jié)果看，固氮菌肥的施用促進(jìn)了蔬菜的生長發(fā)育，使菠菜的株高、葉綠素含量和Vc含量等指標(biāo)顯著增加。本試驗(yàn)主要做了固氮菌肥對菠菜和空心菜的肥效試驗(yàn)，至于固氮菌肥對其它蔬菜的效果以及在生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用，還需要通過大田試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。又由于在不同氮水平下固氮菌肥對作物的肥效存在差異，下一步可以探討固氮菌肥的有效土壤氮素范圍，以實(shí)現(xiàn)優(yōu)化配比施肥和有效施肥。

本研究制作的固氮菌肥符合復(fù)合微生物肥標(biāo)準(zhǔn)NY/T 798-2004。固氮菌肥無論是保存期內(nèi)的有效活菌數(shù)還是對蔬菜的促生效果都較明顯，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供了良好的肥料，符合生態(tài)農(nóng)業(yè)的發(fā)展趨勢，具有廣闊的發(fā)展前景。

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