李莉玲

（廣東惠州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學院 藥學系，廣東 惠州 516005）

巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）是19世紀80年代初期發(fā)展起來的一種新型的外源蛋白表達系統(tǒng)，在生物表達系統(tǒng)中研究最為廣泛。巴斯德畢赤酵母具有易于高密度發(fā)酵、培養(yǎng)基成本低、外源基因整合穩(wěn)定、外源蛋白以分泌蛋白形式存在、內(nèi)生蛋白較少，以及蛋白翻譯后真核加工等優(yōu)點。該系統(tǒng)相較其他表達系統(tǒng)而言，彌補了大腸桿菌表達系統(tǒng)不易表達復雜蛋白的限制以及植物、動物細胞表達系統(tǒng)周期長、操作繁瑣、成本高的缺點，完善了釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）分泌效率低、表達菌株不夠穩(wěn)定、表達質(zhì)粒易丟失等缺陷，迅速成為各國科學工作者的研究熱點。

但是人們也發(fā)現(xiàn)了巴斯德畢赤酵母外源表達系統(tǒng)的不足。在表達外源蛋白時，巴斯德畢赤酵母重組菌往往存在比較嚴重的蛋白降解現(xiàn)象。酵母表達外源糖蛋白時會對蛋白進行過度N-糖基化修飾，產(chǎn)生高甘露糖型糖鏈，影響蛋白的活性，從而限制了巴斯德畢赤酵母表達人源型蛋白表達在醫(yī)藥方面的應用。隨著2009年巴斯德畢赤酵母全基因組測序和注釋工作的完成，人們對影響其轉(zhuǎn)錄調(diào)控、表達調(diào)控及翻譯后修飾等機理有了進一步的了解，可以通過相關(guān)基因的敲除達到影響表達蛋白途徑，從而實現(xiàn)改良的畢赤酵母重組菌的構(gòu)建。

巴斯德畢赤酵母中常用的直接基因缺失的方法主要分為兩類：有標記的插入替換方法和無標記的Pop-In/Pop-Out方法［1］。

1 有標記的插入替換方法

有標記的插入替換方法以抗性基因作為篩選標記，在抗性基因片段兩邊通過PCR 擴增接上被敲除基因在宿主基因兩邊的同源片段。將兩端連有同源片段的抗性基因通過雙酶切后連入載體質(zhì)粒。以該重組質(zhì)粒為模板得到兩端連有同源片段的抗性基因重組片段，整合到宿主菌體內(nèi)，發(fā)生同源重組，導致插入的抗性基因替換掉宿主染色體上的目的基因，從而實現(xiàn)目的基因的敲除。

圖1 基因直接插入替換原理圖[1]

華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室的倪振華等人采用sh ble抗性基因作為篩選標記，采用插入替換的方法構(gòu)建Polycomb Repressive Complex 1（PRC1）基因缺失菌株。方法原理見圖1。其中圖中的右斜線代表基因的5’序列，左斜線代表PRC1基因的3’序列。

最后將電轉(zhuǎn)化后的菌液涂布在Zeocin（博來霉素）抗性平板上，30℃培養(yǎng)兩到三天，挑選轉(zhuǎn)化子進行不同部位引物的PCR鑒定，最后證實PRC1基因缺失。

圖2 PCR鑒定原理圖[1]

2 無標記的Pop-In/Pop-Out方法

2001年Soderholm 構(gòu)建了一個通過Pop-In/Pop-Out 實現(xiàn)巴斯德畢赤酵母基因取代的載體pPOP（5544bp）［2］。該載體含有一個T-urf13標記基因以及與腺嘌呤生產(chǎn)有關(guān)的ARG4基因。把目的基因接入多克隆位點，然后轉(zhuǎn)入宿主菌體內(nèi)，發(fā)生兩次同源重組，實現(xiàn)了目的基因到宿主菌基因組的無標記性整合。為基因的無標記敲除提供了思路和方法。

第一個是使用尿嘧啶生物合成基因，如URA3和URA5作為反向篩選標記，同時利用表達野生型的尿嘧啶生物合成基因的細胞不能在含有5-氟乳清酸存在下生長而進行篩選。第二個方法，同樣基于反向篩選標記，引入來自T-urf13雄性不育玉米的線粒體基因組作為反向篩選標記，當滅多蟲存在的時候反向篩選。另一個是Cre-loxP重組系統(tǒng)，兩個loxP位點（loxP71、loxP66）連在標志基因的兩側(cè)，在Cre重組酶的表達下，兩個loxP位點有效地重組變成單個loxP，從而導致標記基因被刪除。這三種方法各有自己的優(yōu)點和缺點，已成為巴斯德畢赤酵母兩步基因重組敲除基因的常用的方法。

2.1 URA3作為反向篩選標記

URA5可作為反向篩選標記，而且已經(jīng)被用于構(gòu)建一系列整合載體，實現(xiàn)畢赤酵母的基因穩(wěn)定改造［3］。

URA3作為反向篩選標記的Pop-In/Pop-Out方法，主要是利用了URA3基因所編碼的酶是尿嘧啶合成的關(guān)鍵酶，該酶能把5-FOA（5-氟乳清酸）轉(zhuǎn)化成對細胞有毒的物質(zhì)，使得帶有URA3基因的菌株不能在含有5-FOA的培養(yǎng)基上生長，而缺失URA3基因的酵母則不能在尿嘧啶缺陷的培養(yǎng)基上生長。

一般的方法是將一個帶兩個標記基因（URA3以及兩端含被敲除基因同源臂的編碼營養(yǎng)物的基因，以ADE為例）的Pop-In/Pop-Out載體通過同源重組轉(zhuǎn)入相應的營養(yǎng)缺陷型的畢赤酵母菌株，通過兩次同源重組實現(xiàn)對目的基因敲除。第一次重組后兩個標記基因都進入畢赤酵母染色體，此時可用含有5-FOA的培養(yǎng)基進行篩選。然后將不能在5-FOA的培養(yǎng)基生長的重組菌在豐富培養(yǎng)基中培養(yǎng)擴增，其中一些重組菌由于染色體中重復的兩個同源臂序列之間發(fā)生同源交換，導致染色體上包括URA基因在內(nèi)的敲除質(zhì)粒骨架序列的切除以及重復區(qū)段中兩個拷貝之一的丟失，即發(fā)生了二次重組。二次重組可能產(chǎn)生兩種菌：不含兩種篩選標記基因的野生型菌株與保留了ADE基因的成功敲除目的基因的重組菌。最后通腺嘌呤缺陷的含5-FOA的培養(yǎng)基進行二次篩選，得到敲除成功的菌株。原理如圖3所示。

圖3 URA3作為反向篩選標記的Pop-in/Pop-out方法[4]

圖中敲除質(zhì)粒的ADE1基因可根據(jù)被敲除菌株的特性替換成相應的標記基因，其起到輔助篩選的作用，可大大降低篩選的工作量，提高篩選突變株的效率。而URA3是一個不可替代的關(guān)鍵性篩選標記，可作為一種正負篩選標記使用。在插入ADE1基因的位置上也可以不引入篩選標記基因，只利用URA3單個篩選標記利用兩步置換的方法在敲除目標基因是可行的，但是這種方法在篩選突變株時會增加篩選的工作量。

利用URA3作為反向篩選標記兩步重組敲除基因的方法有一個缺點：即使是在提供了尿嘧啶的培養(yǎng)基里，巴斯德畢赤酵母尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株依然生長得很慢。這可能是因為尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型的巴斯德畢赤酵母不能很好地利用培養(yǎng)基里的尿嘧啶。由于生長緩慢的限制，這樣的菌株很難作為生產(chǎn)工程菌在工業(yè)上的廣泛應用。

2.2 T-urf13（?；衩譚型胞質(zhì)不育基因）作為反向篩選標記

來自雄性不育玉米的線粒體基因組的T-urf13 基因，編碼一個賦予細胞T-型雄性不育特性的13-kD 的多肽［5］。早前的研究發(fā)現(xiàn)含該基因的釀酒酵母重組菌細胞對殺蟲劑滅多蟲很敏感，同時在普通的生長條件下該重組菌幾乎不體現(xiàn)任何生長受抑制的現(xiàn)象，并且這一發(fā)現(xiàn)在巴斯德畢赤酵母身上也非常相似［2］。因而條件致死的T-urf13基因可作為替代URA3的反向篩選標記，避免了生長緩慢的尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型巴斯德畢赤酵母重組菌的產(chǎn)生，得到二次重組后的基因敲除菌。

這一方法也是先構(gòu)建一個含T-urf13基因與正向篩選標記基因的敲除質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)入畢赤酵母重組菌中。再利用正向篩選標記篩選得到第一次重組成功的陽性轉(zhuǎn)化子，并將其在含methomyl的培養(yǎng)基進行反向篩選。載體上的T-urf13反向篩選標記使菌株在滅多蟲平板上致死。同時，在這種致死壓力下，宿主為了存活下來，迫使插入載體在內(nèi)部發(fā)生雙交換同源重組，去除插入載體［6］。只有去除了插入載體的重組菌才能在methomyl 平板上存活。原理圖如下所示：

圖4 T-urf13作為反向篩選標記的Pop-in/Pop-out[1]

圖中的正向篩選標記sh ble基因可用其他正向篩選標記替代。

然而，T-urf13基因的毒性使得轉(zhuǎn)化的菌株很少能存活，并因某些基因被刪除可能導致條件致死，從而限制了該方法的推廣使用。

2.3 Cre-loxP重組系統(tǒng)

Cre-loxP重組系統(tǒng)在釀酒酵母中已經(jīng)使用得比較成熟，2008年被作為一種快速和方便的實現(xiàn)無標記基因刪除的方法在在巴斯德畢赤酵母中應用。

Cre/mutated lox 系統(tǒng)、Zeocin 抗性標記和同源臂通過融合PCR 被疊接在一起，構(gòu)成基因刪除盒子（同源區(qū)域-lox71-Cre-ZeoR-lox66-同源區(qū)域），這個能通過同源重組整合到巴斯德畢赤酵母基因組上。把雙交換的重組子轉(zhuǎn)移到甲醇誘導的培養(yǎng)基后，Cre 重組酶的瞬時表達導致lox71-Cre-ZeoR-lox66 片段變成一個雙突變的lox72 位點的重組反應，從而從巴斯德畢赤酵母基因組中刪了Cre-ZeoR盒子。原理圖如下：

圖5 （a）Cre-loxP系統(tǒng).（b）Cre-ZeoR盒子.（c）該非標記的基因刪除策略.[7]

Cre-loxP重組系統(tǒng)已被成功用于引起單基因或者雙基因的刪除。2011年，南京農(nóng)業(yè)大學的研究人員在巴斯德畢赤酵母基因組里用進行了HIS4基因的成功敲除，并在這個重組菌的基礎上進一步實現(xiàn)PEP4基因的敲除［6］。而且二次敲除中，前次留下的雙突變lox72位點沒有影響后來引入的刪除盒l(wèi)ox71與lox66之間的在Cre重組酶調(diào)節(jié)的重組。

近年來，Cre-loxP重組系統(tǒng)已經(jīng)被廣泛用于多種生物體里。38-kDa的Cre蛋白催化兩個loxP位點之間的輔助因子獨立的重組。當兩個loxP位點被放置相同的方向，Cre介導的重組可以刪除他們側(cè)面的基因序列，同時留下一個loxP在后面。然而，當反復地使用這系統(tǒng)在同一基因背景里，一個共同的關(guān)注點是可能的重組會發(fā)生在新引進的loxP位點和前面的留在基因組里loxP位點。為了解決這個難題，突變loxP片段被產(chǎn)生。特別流行的是lox71和lox66，每一個都包含著一個5-bp改變在回文序列。lox71和lox66的重組導致一個天然的loxP位點和一個雙突變的lox72位點。留在在染色體上的雙突變的lox72位點對Cre重組酶顯示出著強還原的結(jié)合能力，同時幾乎不參加序列重組。所以這個方法可以被連續(xù)地用來中斷巴斯德畢赤酵母的基因，而不需要引入篩選標記。

2.4 另一種Pop-In/Pop-Out方法

利用反向篩選標記的兩步法同源重組實現(xiàn)畢赤酵母基因敲除的方法，都是基于敲除質(zhì)粒的構(gòu)建去引入同源臂，然后在生長壓力條件下，利用兩拷貝同源臂之間的相同序列實現(xiàn)二次重組，再利用標記基因篩選出基因敲除后的重組菌。為了提高篩選效率，常根據(jù)被敲除的宿主菌的性質(zhì)同時引入一個正向篩選標記，進行正反向篩選。URA3基因與T-urf13基因是兩個常用作Pop-In/Pop-Out方法里的反向篩選標記，但由于它們分別給重組畢赤酵母帶來的生長緩慢以及毒性導致的低存活率都限制了這兩種反向標記實現(xiàn)非標記敲除基因方法的應用。

大腸桿菌的mazF 作為一種新的反向篩選標志被用于巴斯德畢赤酵母的Pop-In/Pop-Out 敲除基因［8］。mazF編碼一個毒素MazF，這是一個重要的毒素-抗血清系統(tǒng)，介導的細胞程序性死亡。MazF作為一種mRNA干擾酶，會優(yōu)先切斷在ACA（特定序列）上的單鏈mRNA以阻止蛋白合成，導致細胞生長阻遏［9］。

mazF基因被放置在誘導的表達系統(tǒng)里，同時Zeocin抗性基因作為一個正向的篩選標志。但是一般用于在功能基因片段中插入一段序列，以破壞該基因的正常轉(zhuǎn)錄與翻譯，從而實現(xiàn)基因的功能缺失。

3 位點特異性的核酸酶系統(tǒng)

近十年來發(fā)展了一種新的研究手段，可以對各種細胞和各種生物體內(nèi)的幾乎任意基因進行人工操作，這種新技術(shù)被稱為“基因組編輯技術(shù)（genome editing）”，由序列特異性的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與非特異性的DNA切割結(jié)構(gòu)域組合而成的人工核酸酶就是基因組編輯技術(shù)的重要組成部分。這些嵌合式的核酸酶能夠以極高的效率、極高的精確度對基因組進行人工修飾［10］。

ZFN（鋅指核糖核酸酶，Zinc-finger nucleases）是由FokI 限制性核酸內(nèi)切酶當中的非特異性的DNA 切割結(jié)構(gòu)域和鋅指蛋白（zinc-nger protein）組合而成的。ZFN 二聚體（dimers）能夠促使DNA 斷裂形成DSB（double-strand breaks，DNA雙鏈斷裂缺口），，進而誘發(fā)DSB修復機制。鋅指結(jié)構(gòu)域的靶向功能使ZFN能夠?qū)蚪M中的特定位點進行定向改造。TALEN（轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應因子核酸酶，transcription activator-like effector nuclease）主要由Fok I內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域和TALE蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域組合而成。TALE蛋白含有多個33-35個氨基酸組成的重復肽段，而每一個肽段都能夠識別一個堿基。與ZFN 一樣，TALEN 也能使DNA 靶序列斷裂，形成DSB，進而激活DNA損傷修復機制，對基因組進行定點改造。

ZFN 和TALEN 都可以對DNA 進行各種遺傳修飾，它們的作用機制都是先對DNA 雙鏈分子進行切割，形成DNA雙鏈斷裂切口，然后激活細胞內(nèi)的非同源末端連接修復機制，或者同源重組修復機制，再利用細胞自身的修復機制對DNA進行遺傳學修飾。

在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)入位點特異性的核酸酶和攜帶有位點特異性同源序列的外源質(zhì)粒，能夠以極高的效率在細胞基因組特定的位點轉(zhuǎn)入一個或者多個轉(zhuǎn)基因序列（圖6A）。通過這種方法，可以轉(zhuǎn)入一段不超過50bp的線性外源同源序列或者單鏈的DNA寡核苷酸鏈，在細胞基因組內(nèi)的特定位點引入替換突變、缺失突變或者插入突變。位點特異性的核酸酶除了能夠提高同源重組的效率之外，還能夠以很快的速度構(gòu)建null表型（null phenotype）的細胞系和模式生物。這些核酸酶產(chǎn)生DSB之后如果啟動了NHEJ（非同源末端連接修復機制）修復機制，那么就會在DSB位點處引入小段的缺失突變或者是插入突變，使基因發(fā)生移碼，從而起到敲除基因功能的作用（圖6B）。這些位點特異性的核酸酶還能夠引入大段的染色體缺失突變，使染色體發(fā)生大段的倒位（inversion）和轉(zhuǎn)位（translocation）。

圖6 A/B使用位點特異性核酸酶進行基因組編輯操作。

核酸酶切割DNA 形成DSB 之后細胞可能會借助同源重組修復途徑，或者是NHEJ（非同源末端連接修復機制）修復途徑對DSB進行修復。（A）在缺乏外源質(zhì)粒DNA模版的情況下，細胞會通過NHEJ機制進行修復，在基因組中形成小型的插入或者缺失突變。在存在雙鏈寡聚核苷酸分子，或者在細胞內(nèi)存在線性的質(zhì)粒片段時，可以通過NHEJ機制在基因組中插入大段的DNA序列，最長可以插入14kb的序列。同時形成兩種DSB之后會形成缺失、倒位或者倒位的序列轉(zhuǎn)位等突變。（B）在存在同源序列的外源模版的情況下，細胞會通過同源重組修復機制修復DSB，在基因組內(nèi)插入1個或者多個轉(zhuǎn)基因，或者對基因組中的錯誤基因進行修復［10］。

4 展望

巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)，彌補了大腸桿菌表達系統(tǒng)不易表達復雜蛋白的限制以及植物、動物細胞表達系統(tǒng)周期長、操作繁瑣、成本高的缺點，完善了釀酒酵母分泌效率低、表達菌株不夠穩(wěn)定、表達質(zhì)粒易丟失等缺陷，是一種優(yōu)秀外源蛋白表達系統(tǒng)。但其自身還存在著表達人源性蛋白時過糖基化等缺點，仍有待進一步優(yōu)化。

基因敲除是酵母研究中最有效和最重要的技術(shù)之一。對于釀酒酵母的基因敲除技術(shù)發(fā)展得比較成熟，釀酒酵母的基因敲除只需幾十至幾百個堿基的同源臂序列，且敲除效率較高；而對于畢赤酵母而言，基因敲除需要幾百乃至上千個堿基的同源臂序列，且敲除效率遠低于釀酒酵母，尤其是對于一些影響菌體生長、代謝的基因，其敲除效率很低，往往難以獲得正確敲除的菌株。因而，尋找高效的巴斯德畢赤酵母基因敲除方法對進一步研究和優(yōu)化巴斯德蛋白表達系統(tǒng)有著重要的意義。

有標記的插入替換基因缺失方法操作簡單，比較容易篩選得到基因缺失菌。目前在畢赤酵母中可用的篩選標記有限，因而有標記的插入替換方法在進行多基因缺失時具有一定的局限性。無標記的Pop-In/Pop-Out方法相對比較復雜，篩選工作量大。但是在基因缺失后，宿主菌的染色體上不會留下任何外源片段，特別適合多基因缺失或是改造基因工程菌。

URA3、T-urf13、mazF 基因作為反向篩選標記的Pop-In/Pop-Out 方法敲除基因，是基于敲除質(zhì)粒的構(gòu)建去引入同源臂，然后在生長壓力條件下，利用兩拷貝同源臂之間的相同序列實現(xiàn)二次重組，再利用標記基因篩選出基因敲除后的重組菌。為了提高篩選效率，常根據(jù)被敲除的宿主菌的性質(zhì)同時引入一個正向篩選標記，進行正反向篩選。但在標記刪除達到之前時常需要多于10天的時間，比較耗時。

同樣是通過兩步同源重組實現(xiàn)基因敲除，Cre-loxP重組系統(tǒng)不依賴于敲除質(zhì)粒的構(gòu)建，而是通過構(gòu)建刪除表達盒。Cre-loxP 重組系統(tǒng)只需引入一個正向篩選標記，同時它的二次重組是依賴于Cre 重組酶催化的loxP71 與loxP66之間的重組，只需啟動Cre的轉(zhuǎn)錄翻譯即可，較需要生長壓力條件來實現(xiàn)菌體自身二次重組的反向篩選標記的方法要簡單、快捷。因而，Cre-loxP重組系統(tǒng)在巴斯德畢赤酵母的基因敲除方法中具有巨大的應用前景，為進一步優(yōu)化多基因缺失與改造畢赤酵母基因工程菌的方法提供了思路。

序列特異性的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與非特異性的DNA切割結(jié)構(gòu)域組合而成的人工核酸酶是基因組編輯技術(shù)的重要組成部分，ZFN和TALEN等嵌合式的核酸酶能夠以極高的效率、極高的精確度對基因組進行人工修飾。

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