蔣菁蕊 劉 媛 吳少亙 曹望森 崔恒宓,3# 于成功#

南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院消化科1(210008) 南京大學醫(yī)學院2 揚州大學表觀遺傳學及表觀基因組學研究所3

Cell Proliferation

結直腸癌是常見且多發(fā)的消化道惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率呈上升趨勢。抑癌基因表達抑制在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用，是結直腸癌的發(fā)病機制之一。肝癌缺失基因1(deleted in liver cancer 1, DLC1)于1998年首次被發(fā)現，該基因定位于8p21.3-22，編碼1 091個氨基酸，與鼠源p122 Rho GAP有86%的同源性，在多種實體腫瘤中低表達或完全沉默[1-3]。Zhou等[4]的研究顯示，DLC1可抑制腫瘤細胞生長，誘導細胞凋亡，并通過調節(jié)肌動蛋白細胞骨架結構和黏著斑影響細胞遷移。已知一些microRNAs可通過調節(jié)抑癌基因的表達影響腫瘤發(fā)生。miR-483位于腫瘤相關基因胰島素樣生長因子2(IGF2)的第7號內含子內，其前體發(fā)夾結構有2個亞單位，即3’端的miR-483-3p和5’端的miR-483-5p，研究[5]發(fā)現結直腸癌組織中的miR-483-3p表達水平明顯高于正常結直腸組織。根據Targetscan數據庫預測，miR-483-3p可與DLC1 3’非翻譯區(qū)(3’UTR)的對應序列靶向結合，可能通過降解DLC1 mRNA或抑制其翻譯而降低其蛋白水平，從而影響DLC1的抑癌作用。本研究通過檢測結直腸癌組織中的DLC1和miR-483-3p表達水平，并探討miR-483-3p對DLC1表達的靶向調節(jié)作用，以期闡明miR-483-3p在結直腸癌發(fā)生中的作用機制。

材料與方法

一、標本獲取

納入2012年10月～2013年4月南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院收治的結直腸癌患者16例，其中男7例，女9例，年齡45～84歲，平均(64.1±13.9)歲。采集癌組織及其相應癌旁非癌組織(距癌組織邊緣4～5 cm)標本，所有標本均經HE染色后由組織病理學檢查確診，病理類型均為腺癌，Dukes分期A期1例，B期2例，C期12例，D期1例。研究方案經南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，入選患者均簽屬知情同意書。

二、細胞株和主要試劑

人結腸癌細胞株HCT116、人胚腎細胞株HEK293T(南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院消化科實驗室保存)。鼠抗人DLC1單克隆抗體(美國BD公司)，羊抗鼠IgG-HRP[生興生物技術(南京)有限公司]，Trizol試劑、microRNA逆轉錄試劑盒、Taqman探針試劑盒、Lipofectamine?2000轉染試劑盒(美國Invitrogen 公司)，q-PCR Mix(美國ABI公司)，pmirGLO雙熒光素酶報告基因載體(美國Promega公司)，限制性內切酶XhoⅠ、XbaⅠ(美國Fermentas公司)，miR-483-3p mimic、陰性對照mimic(廣州銳博生物科技有限公司)，CCK-8試劑盒(日本同仁化學研究所)。

三、方法

1. 蛋白質印跡法檢測結直腸癌組織和癌旁非癌組織DLC1表達：取癌組織和癌旁非癌組織，加入RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白含量。每一樣本取100 μg總蛋白上樣，SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，封閉，加入鼠抗人DLC1單克隆抗體(1∶200) 4 ℃過夜，加入羊抗鼠IgG HRP(1∶5 000)室溫孵育1 h，ECL顯影，定影，凝膠成像系統(tǒng)拍照、分析。

2. qRT-PCR檢測結直腸癌組織和癌旁非癌組織miR-483-3p表達：取癌組織和癌旁非癌組織，以Trizol試劑提取總RNA，參照microRNA逆轉錄試劑盒說明書行逆轉錄，反應條件：16 ℃ 30 min； 42 ℃ 30 min；85 ℃ 5 min；4 ℃控溫。q-PCR反應采用Taqman探針法，選用U6作為內參照，反應條件：95 ℃ 15 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)。2-ΔΔCt法計算miR-483-3p相對表達量。

3. pmirGLO-DLC1 WT和pmirGLO-DLC1 MUT載體構建：在Targetscan數據庫中查找得到DLC1 3’UTR序列中與miR-483-3p互補的種子序列為AGGAGTG，以NCBI數據庫中查找得到的DLC1(Gene ID：10395) 3’UTR序列為模板設計引物，上游引物：5’-CCG CTC GAG GCT TCC TGT TTG TTG AGG GTC T-3’(劃線處為XhoⅠ酶切位點)，下游引物：5’-CTA GTC TAG AAA GGC TAG AGG GAG CAG TTC AT-3’(劃線處為XbaⅠ酶切位點)。PCR擴增片段長度為677 bp，包含miR-483-3p靶位序列。PCR產物經XhoⅠ和XbaⅠ酶切后，與同樣經酶切的pmirGLO載體進行連接，所構建的野生型載體命名為pmirGLO-DLC1 WT。設計種子序列的突變序列為AGGCTGG(劃線處為突變后堿基)，采用重疊延伸PCR法誘導定點突變，突變型上游引物：5’-TGC ACA GAG GCT GGT GAA TGT G-3’，下游引物：5’-ACA CAT TCA CCA GCC TCT GTG C-3’，酶切和連接方法同野生型載體，所構建的突變型載體命名為pmirGLO-DLC1 MUT。以上引物合成和載體測序鑒定均由上海桑尼生物技術公司完成。

4. 熒光素酶報告基因檢測實驗：HCT116細胞以含10%胎牛血清的McCoy’s 5A培養(yǎng)基培養(yǎng)，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過夜貼壁，制成細胞懸液，調整密度為2×105/mL，以每孔1 mL接種于12孔板，待細胞密度至70%，參照Lipofectamine?2000轉染試劑盒說明書進行操作，分別將pmirGLO-DLC1 WT或pmirGLO-DLC1 MUT與miR-483-3p mimic或陰性對照mimic共轉染HCT116細胞，報告基因質粒為200 ng/孔，核酸濃度為50 nmol/L，5 h后棄轉染液，更換為新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后進行細胞裂解，提取細胞裂解液。取熒光素酶報告分析儀專用檢測板，每孔加入10 μL熒光素酶催化底物與10 μL細胞裂解液混勻，Promega熒光測定儀測定熒光素酶活性。每組設3個復孔，實驗重復3次。對螢火蟲熒光素酶熒光值與海腎熒光素酶熒光值的比值進行校正，作為各孔報告基因熒光強度值。

5. 蛋白質印跡法檢測miR-483-3p對HEK293T細胞DLC1表達的影響：HEK293T細胞經胰酶消化后制成單細胞懸液，調整細胞密度，接種至6孔板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過夜貼壁，分別以50、100 nmol/L miR-483-3p mimic或陰性對照mimic轉染細胞48 h、60 h，蛋白質印跡法檢測同步驟1。

6. CCK-8實驗檢測miR-483-3p對HCT116細胞增殖的影響：取對數生長期HCT116細胞制成單細胞懸液，以1×104/孔接種至96孔板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過夜貼壁，分別以50、100 nmol/L miR-483-3p mimic或陰性對照mimic轉染細胞 24 h、 48 h，每孔加入10 μL CCK-8試劑，酶標儀測定450 nm 波長處吸光度(A)值。每組設5個復孔，實驗重復3次。

四、統(tǒng)計學分析

結 果

一、結直腸癌組織、癌旁非癌組織DLC1表達

蛋白質印跡法檢測結果顯示，16例結直腸癌患者中10例(62.5%)癌組織DLC1表達水平顯著低于癌旁非癌組織(見圖1)。

1 Da=0.992 1 u

圖1結直腸癌組織、癌旁非癌組織DLC1表達(蛋白質印跡法)

二、結直腸癌組織、癌旁非癌組織miR-483-3p表達

qRT-PCR檢測結果顯示，16例結直腸癌患者癌組織中的miR-483-3p表達水平均不同程度地高于癌旁非癌組織，10例DLC1低表達者癌組織與癌旁非癌組織相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見圖2)。

圖210例DLC1低表達結直腸癌患者癌組織、癌旁非癌組織miR-483-3p表達

三、miR-483-3p靶向調控DLC1表達

熒光素酶報告基因檢測結果顯示，pmirGLO-DLC1 WT與miR-483-3p mimic共轉染HCT116細胞后，熒光素酶活性較pmirGLO-DLC1 WT與陰性對照mimic共轉染顯著降低(P<0.01)；而pmirGLO-DLC1 MUT與miR-483-3p mimic共轉染HCT116細胞后，熒光素酶活性與pmirGLO-DLC1 MUT與陰性對照mimic共轉染相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見圖3)，證實DLC1是由miR-483-3p調控的靶基因。

四、miR-483-3p對HEK293T細胞DLC1表達的影響

蛋白質印跡法檢測結果顯示，50、100 nmol/L miR-483-3p mimic轉染內源性DLC1表達水平較高的HEK293T細胞48 h后，DLC1表達水平與陰性對照組相比無明顯差異；轉染60 h后，100 nmol/L miR-483-3p mimic組DLC1表達水平較陰性對照組顯著降低，50 nmol/L組與陰性對照組間則無明顯差異(見圖4)。

A：pmirGLO-DLC1 WT與陰性對照mimic共轉染；B：pmirGLO-DLC1 WT與miR-483-3p mimic共轉染；C：pmirGLO-DLC1 MUT與陰性對照mimic共轉染；D：pmirGLO-DLC1 MUT與miR-483-3p mimic共轉染

圖3miR-483-3p靶向調控DLC1表達

1：陰性對照mimic；2：miR-483-3p mimic

圖4miR-483-3p對HEK293T細胞DLC1表達的影響(蛋白質印跡法)

五、miR-483-3p對HCT116細胞增殖的影響

CCK-8實驗結果顯示，50、100 nmol/L miR-483-3p mimic轉染HCT116細胞24 h后，細胞增殖能力與陰性對照組相比無明顯變化(P>0.05)；轉染48 h 后，50、100 nmol/L miR-483-3p mimic組細胞增殖能力均較陰性對照組顯著增強(P<0.05)(見圖5)，但兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

A: 50 nmol/L 轉染濃度；B: 100 nmol/L 轉染濃度

圖5miR-483-3p對HCT116細胞增殖的影響(轉染48h)

討 論

DLC1是一種重要的抑癌基因，目前已在多種惡性腫瘤如肝癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌中發(fā)現DLC1表達降低或缺失，結直腸癌患者中約43%存在DLC1表達降低或缺失[6]。DLC1可通過自身多個結構域如Rho GAP、START、SAM發(fā)揮抑癌作用[7]，其中Rho GAP結構域的抑癌作用受到較多關注，其可通過調節(jié)Rho蛋白RhoA、RhoC、Cdc42三個亞型的表達，影響細胞增殖、凋亡和遷移[8]。本研究結果顯示，62.5%的結直腸癌患者癌組織DLC1表達水平較癌旁非癌組織顯著降低，與上述研究結果相符。然而本研究樣本量較小，未能進一步按病理分期分組，分析DLC1表達與結直腸癌病理分期的關系，有待后續(xù)擴大樣本量作進一步研究。

表觀遺傳學調節(jié)異常在結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中，尤其是抑癌基因的調節(jié)中發(fā)揮重要作用，對DLC1表達的相關調節(jié)機制包括啟動子甲基化、組蛋白去乙?；约癿icroRNAs的轉錄后水平調節(jié)[9-10]。microRNAs對基因表達的調節(jié)作用主要是抑制靶基因mRNA翻譯或降解靶mRNA，從而降低靶基因蛋白水平。IGF2是較早發(fā)現的內源性印跡基因，其缺失可導致結直腸癌等多種腫瘤發(fā)生[11]。miR-483-3p位于IGF2基因內含子內，兩者表達水平呈正相關，提示miR-483-3p可能作用于抑癌基因，促進腫瘤發(fā)生[5]。本研究通過熒光素酶報告基因檢測實驗證實，DLC1為miR-483-3p的靶基因，miR-483-3p可靶向結合DLC1的種子序列而抑制其表達，導致蛋白水平降低。為驗證miR-483-3p對DLC1表達的影響，本研究進一步以miR-483-3p mimic轉染DLC1表達水平較高的HEK293T細胞并檢測細胞內DLC1表達情況，結果顯示較高濃度(100 nmol/L)、較長時間(60 h)轉染miR-483-3p mimic可顯著抑制DLC1表達，進一步證實DLC1是miR-483-3p的靶基因。此外，CCK-8實驗結果顯示，miR-483-3p mimic較長時間(48 h)轉染HCT116細胞后，細胞增殖能力顯著增強，提示miR-483-3p抑制DLC1表達對結直腸癌的發(fā)生具有促進作用。

綜上所述，本研究通過蛋白質印跡法和qRT-PCR檢測發(fā)現，結直腸癌組織DLC1表達水平降低， miR-483-3p表達水平增高；進一步的熒光素酶報告基因檢測實驗發(fā)現miR-483-3p可直接與DLC1的3’UTR結合而抑制其表達，進而促進結腸癌細胞增殖，證實miR-483-3p可在轉錄后水平抑制DLC1表達，參與促進結直腸癌發(fā)生。本研究揭示了miR-483-3p在結直腸癌發(fā)生中的作用機制，然而miR-483-3p能否作為結直腸癌的治療靶點和發(fā)生風險評估指標，仍有待進一步研究。

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