劉 超 高軍麗 樂貽軍 鐘雄平 陳業(yè)金 王 紅#

廣州市第一人民醫(yī)院消化科1(510180) 威海市立醫(yī)院急診科2

Prognosis

結(jié)直腸癌作為人類常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率在全球居高不下。臨床就診的結(jié)直腸癌患者大多屬于中晚期，患者的5年生存率較低。范科尼貧血(Fanconi anemia, FA)通路作為研究染色體不穩(wěn)定性的特有遺傳模型，是近年來腫瘤基礎(chǔ)研究的熱點。FA是一種常染色體或X-連鎖隱性遺傳性疾病，由調(diào)節(jié)DNA損傷的FA通路相關(guān)基因突變引起，以先天畸形、骨髓衰竭以及高度腫瘤易感性為主要表現(xiàn)。FA患者易患腫瘤，包括頭頸部腫瘤、乳腺癌、膀胱癌、非小細(xì)胞肺癌等，F(xiàn)A通路在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。然而，目前FA通路及其相關(guān)蛋白在結(jié)直腸癌中的作用尚未明確，相關(guān)研究數(shù)量有限。范科尼貧血互補(bǔ)群D2(FANCD2)作為FA通路的關(guān)鍵基因，是FA通路激活的標(biāo)志，在FA通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究通過檢測FANCD2在結(jié)直腸癌中的表達(dá)，分析FANCD2與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系，旨在為結(jié)直腸癌的診斷、治療以及預(yù)后判斷提供新途徑。

對象與方法

一、研究對象

收集2012年5月～2013年9月廣州市第一人民醫(yī)院外科新鮮結(jié)直腸癌及其相應(yīng)癌旁非癌組織手術(shù)切除標(biāo)本56例，其中男30例，女26例，年齡28～76歲，平均(60.23±14.23)歲。所有病例均經(jīng)術(shù)后組織病理學(xué)檢查確診。納入2008年1月～2009年4月于廣州市第一人民醫(yī)院行結(jié)直腸癌手術(shù)患者93例，其中男51例，女42例，年齡25～86歲，平均(64.82±12.95)歲，收集其結(jié)直腸癌手術(shù)石蠟標(biāo)本。所有患者術(shù)前均未行放、化療。本研究方案經(jīng)廣州市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，入選患者及其家屬簽屬知情同意書。

二、方法

1. 主要試劑和儀器：TRIzol細(xì)胞裂解液，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，SYBR Green qPCR試劑盒(日本TAKARA公司)；兔抗人FANCD2多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)；兩步法抗兔/鼠通用型免疫組化檢測試劑盒(丹麥Dako公司)。熒光定量PCR儀(美國 MJ Research公司)，梯度PCR儀(美國Bio-Rad公司)。

2. 標(biāo)本獲?。航Y(jié)直腸癌標(biāo)本于離體后10 min內(nèi)迅速取材，切取癌組織和距癌灶邊緣5 cm以上相對正常的腸黏膜組織。部分標(biāo)本置于-196 ℃液氮中保存待測；部分以4%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋備用。

3. qPCR：取56例患者的結(jié)直腸癌及其相應(yīng)癌旁非癌組織標(biāo)本，以TRIzol法提取總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，行qPCR檢測FANCD2表達(dá)。FANCD2引物上游：5’-CCG GAA TAT TGG ATT CTC ACA T-3’，下游：5’-TGA TCC GGG TRC TTA CCT G-3’；GAPDH引物上游：5’-GCA CCG TCA AGG CTG AGA AC-3’，下游：5’-TGG TGA AGA CGC CAG TGG A-3’。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，共40個循環(huán)；72 ℃ 5 min。以溶解曲線確定PCR產(chǎn)物的純度，以2-ΔΔCt相對定量法行數(shù)據(jù)分析。

4. 免疫組化染色：將56例患者中的49例標(biāo)本行石蠟包埋，并取93例石蠟包埋標(biāo)本，行免疫組化染色，采用Envision兩步法，具體步驟參照說明書進(jìn)行。以已知陽性切片作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。

結(jié)果判定：FANCD2 免疫組化染色陽性物質(zhì)主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，較少表達(dá)于細(xì)胞核。根據(jù)陽性細(xì)胞比例和陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度綜合判斷染色結(jié)果。陽性細(xì)胞比例評分：0分，無陽性細(xì)胞數(shù)；1分，1%～25%；2分，26%～50%；3分，>50%。陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度評分：0分，無染色；1分，淡黃色；2分，棕黃色；3分，棕褐色。陽性標(biāo)記評分=陽性細(xì)胞比例評分×陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度評分：0～2分，(-)；3～4分，(+)；5～6 分，(++)；7～9分，(+++)；其中≥(+)為陽性表達(dá)，(-)為陰性表達(dá)。

5. 術(shù)后隨訪：對93例患者進(jìn)行隨訪，以手術(shù)結(jié)束作為隨訪起點，以死亡作為隨訪終點，未死亡的患者以2013年11月1日作為隨訪終點。通過門診、電話、信件、再入院病歷記錄等方式隨訪患者生存情況。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、FANCD2 mRNA在結(jié)直腸癌、癌旁非癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系

對56例患者的標(biāo)本行qPCR法檢測結(jié)果顯示，F(xiàn)ANCD2 mRNA在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁非癌組織[0.102(0.047, 0.163)對0.051(0.025, 0.095)](P=0.007)。采集結(jié)直腸癌患者性別、年齡、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Dukes分期、腫瘤部位等臨床病理資料，分析其與結(jié)直腸癌組織FANCD2 mRNA表達(dá)的關(guān)系，以結(jié)直腸癌組織FANCD2 mRNA表達(dá)水平高于相應(yīng)癌旁非癌組織定義為FANCD2 mRNA高表達(dá)，結(jié)果顯示FANCD2 mRNA表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Dukes分期相關(guān)(P<0.05)，與性別、年齡、腫瘤分化程度、腫瘤部位無關(guān)(P>0.05)(見表1)。

表1 FANCD2 mRNA表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系

二、FANCD2蛋白在結(jié)直腸癌、癌旁非癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系

對49例患者的標(biāo)本行免疫組化染色結(jié)果顯示，F(xiàn)ANCD2在結(jié)直腸癌組織中強(qiáng)表達(dá)，在癌旁非癌組織中弱表達(dá)(見圖1)。結(jié)直腸癌組織FANCD2蛋白陽性表達(dá)率為77.6%(38/49)，癌旁非癌組織FANCD2蛋白陽性表達(dá)率為22.4%(11/49)。結(jié)直腸癌組織FANCD2蛋白表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Dukes分期相關(guān)(P<0.05)，與性別、年齡、腫瘤分化程度、腫瘤部位無關(guān)(P>0.05)(見表2)。

A：結(jié)直腸癌組織；B：癌旁非癌組織

臨床病理特征例數(shù)FANCD2蛋白n(%)陽性表達(dá)陰性表達(dá)P值性別 男2721(77.8)6(22.2)0.45 女2217(77.3)5(22.7)年齡(歲) ≤652216(72.7)6(27.3)0.91 >652722(81.5)5(18.5)腫瘤分化程度 中高分化腺癌4636(78.3)10(21.7)1.00 低分化腺癌32(66.7)1(33.3)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 有2318(78.3)5(21.7)0.02 無2620(76.9)6(23.1)Dukes分期 A期～B期2216(72.7)6(27.3)0.03 C期～D期2722(81.5)5(18.5)腫瘤部位 結(jié)腸3124(77.4)7(22.6)0.41 直腸1814(77.8)4(22.2)

三、FANCD2蛋白表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

93例患者中結(jié)直腸癌組織FANCD2蛋白陽性表達(dá)率為66.7%(62/93)。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示結(jié)直腸癌組織FANCD2蛋白陽性表達(dá)患者的術(shù)后5年生存率為35.5%，陰性表達(dá)患者為71.0%，陽性表達(dá)患者的5年生存率較陰性表達(dá)患者顯著降低(P<0.01)(見圖2)。

圖2 不同F(xiàn)ANCD2表達(dá)水平患者的生存曲線

結(jié)直腸癌發(fā)病率在我國逐年升高，早期診斷、判斷預(yù)后并給予積極治療是結(jié)直腸癌治療的關(guān)鍵。目前已發(fā)現(xiàn)有15個基因突變能導(dǎo)致FA發(fā)生，這15個基因所編碼的蛋白組成了FA信號通路[1-2]。FA通路對DNA鏈間交聯(lián)損傷修復(fù)至關(guān)重要，DNA受到損傷后，F(xiàn)A通路被激活，從而對損傷DNA進(jìn)行修復(fù)。若通路中任一環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題，則引起DNA損傷修復(fù)障礙，繼而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。

FANCD2基因位于染色體3p25.3，有44個外顯子，編碼長度為155、162 kDa(1 Da=0.992 1 u)的同工型蛋白質(zhì)。Fu等[3]的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ANCD2可偶聯(lián)pol-eta，在DNA損傷早期對其進(jìn)行修復(fù)。目前關(guān)于FANCD2在腫瘤中的作用存在爭議。Houghtaling等[4]對FANCD2基因敲除的小鼠研究發(fā)現(xiàn)，小鼠對DNA交聯(lián)損傷劑敏感，易患上皮性腫瘤、小眼畸形。然而，Kao等[5]研究了FANCD2表達(dá)與黑色素瘤的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)FANCD2表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞侵犯程度呈正相關(guān)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ANCD2表達(dá)與黑色素瘤的發(fā)生和耐藥性的產(chǎn)生密切相關(guān)。Wysham等[6]對186例散發(fā)型卵巢癌Ⅲ、Ⅳ期患者研究顯示，在早期復(fù)發(fā)患者中，41%的患者FANCD2表達(dá)升高，顯著高于無復(fù)發(fā)患者，且FANCD2高表達(dá)組第一年復(fù)發(fā)率顯著高于低表達(dá)組，提示FANCD2高表達(dá)與卵巢癌預(yù)后相關(guān)。本研究組前期研究[7-8]表明，F(xiàn)A通路參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展。Ozawa等[9]采用qPCR檢測結(jié)直腸癌患者癌組織中FANCD2表達(dá)，結(jié)果顯示FANCD2高表達(dá)是患者預(yù)后不良的標(biāo)志。在上述研究的基礎(chǔ)上，本研究從mRNA和蛋白水平檢測FANCD2在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)，并對93例臨床資料和回訪資料完整的結(jié)直腸癌患者進(jìn)行生存分析，結(jié)果顯示結(jié)直腸癌患者癌組織FANCD2表達(dá)水平顯著高于癌旁非癌組織，F(xiàn)ANCD2與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Dukes分期密切相關(guān)，且FANCD2蛋白陽性表達(dá)組的5年生存率較FANCD2蛋白陰性表達(dá)組明顯降低，提示FANCD2可作為判斷結(jié)直腸癌惡性潛能和預(yù)測預(yù)后的指標(biāo)。

本研究證實FANCD2水平與結(jié)直腸癌惡性潛能相關(guān)，此為判斷結(jié)直腸癌患者預(yù)后提供了參考依據(jù)。然而，本研究尚存在一定不足，如未能明確FANCD2基因的調(diào)控機(jī)制、生存分析樣本量較小以及隨訪時間較短等，此類問題有待后續(xù)進(jìn)一步研究解決。

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3 Fu D, Dudimah FD, Zhang J, et al. Recruitment of DNA polymerase eta by FANCD2 in the early response to DNA damage[J]. Cell Cycle, 2013, 12 (5): 803-809.

4 Houghtaling S, Timmers C, Noll M, et al. Epithelial cancer in Fanconi anemia complementation group D2 (Fancd2) knockout mice[J]. Genes Dev, 2003, 17 (16): 2021-2035.

5 Kao WH, Riker AI, Kushwaha DS, et al. Upregulation of Fanconi anemia DNA repair genes in melanoma compared with non-melanoma skin cancer[J]. J Invest Dermatol, 2011, 131 (10): 2139-2142.

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8 鐘雄平，陳業(yè)金，孔紅祥，等. siRNA沉默RAD18抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞FANCD2蛋白泛素化并增強(qiáng)其對絲裂霉素C 的敏感性[J]. 實用醫(yī)學(xué)雜志, 2013, 29 (11): 1731-1733.

9 Ozawa H, Iwatsuki M, Mimori K, et al. FANCD2 mRNA overexpression is a bona fide indicator of lymph node metastasis in human colorectal cancer[J]. Ann Surg Oncol, 2010, 17 (9): 2341-2348.