楊志曉，史躍偉，林世峰，王志紅，謝升東，任學(xué)良*

（貴州省煙草科學(xué)研究院，貴陽(yáng) 550081）

近年來(lái)，我國(guó)煙葉生產(chǎn)水平大幅提升，煙葉生長(zhǎng)的整齊度和烤后煙葉質(zhì)量的均衡性大大提高[1]；但與國(guó)外優(yōu)質(zhì)烤煙相比，香氣質(zhì)差、香氣量不足、化學(xué)成分不夠協(xié)調(diào)仍是影響我國(guó)煙葉質(zhì)量提高的制約性因素[2]。相關(guān)研究指出，碳氮代謝是烤煙體內(nèi)最基本的代謝過(guò)程，碳氮代謝活動(dòng)的強(qiáng)度、協(xié)調(diào)程度及其在煙葉生長(zhǎng)和成熟過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化模式直接或間接影響煙葉中各類化學(xué)成分的含量和組成比例，對(duì)煙葉品質(zhì)產(chǎn)生重大影響；煙葉碳氮代謝失調(diào)，煙葉香氣質(zhì)差、香氣量不足，煙葉質(zhì)量難以提高[3-4]。類胡蘿卜素是煙葉中重要的致香前體物質(zhì)，烤后煙葉類胡蘿卜素及其降解產(chǎn)物含量和協(xié)調(diào)性，直接影響烤煙的香氣風(fēng)格、香氣質(zhì)和香氣量[5-6]。目前，關(guān)于烤煙碳氮代謝與類胡蘿卜素之間關(guān)系的研究報(bào)道還較少，而在煙葉碳氮代謝過(guò)程中，各種酶的活性變化起著決定性的調(diào)節(jié)作用[7]。因此，本研究以不同基因型烤煙品種 K326、紅花大金元為材料，研究了碳氮代謝關(guān)鍵酶的動(dòng)態(tài)變化及其與類胡蘿卜素之間的相關(guān)關(guān)系，以期為特色優(yōu)質(zhì)煙葉開(kāi)發(fā)和高香氣、低危害烤煙品種選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于 2010年在貴州省貴定縣進(jìn)行。以我國(guó)主栽烤煙品種紅花大金元、K326為試驗(yàn)材料，供試土壤類型為黃壤土，肥力中等，地面平坦向陽(yáng)，排水良好。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用大區(qū)種植，每個(gè)品種各種植0.33 hm2。于2010年4月28日移栽，行距110 cm，株距50 cm。施氮量為 90 kg/hm2，m(N)∶m(P2O5)∶m(K2O)=1∶0.8∶2.5。移栽后55 d時(shí)現(xiàn)蕾初花打頂，每株留葉數(shù)為18片，其他田間管理按照當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術(shù)方法進(jìn)行。選取每個(gè)品種的中部葉（從下向上數(shù)第10～12片葉）作為待測(cè)樣品，取樣時(shí)間分別為移栽后30、45、60、75、90 d。鮮樣取下后立即用液氮冷凍帶回，存于-80℃冰箱待用。

1.3 測(cè)定內(nèi)容與方法

1.3.1 碳氮代謝關(guān)鍵酶活性測(cè)定 硝酸還原酶活性測(cè)定按照活體法進(jìn)行[8]，谷氨酰胺合成酶活性測(cè)定按照分光光度法進(jìn)行[9]，淀粉酶活性測(cè)定按照3,5-二硝基水楊酸比色法進(jìn)行[10]，蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性測(cè)定按照3,5-二硝基水楊酸比色法進(jìn)行[11]，每項(xiàng)測(cè)定指標(biāo)重復(fù)3次。

1.3.2 類胡蘿卜素含量測(cè)定 采用反相高效液相色譜法測(cè)定[12]。準(zhǔn)確稱取0.200 g樣品，放入25 mL試管中，加入25 mL90%（體積分?jǐn)?shù)）的丙酮，室溫下超聲萃取20 min。取約1 mL萃取液，用0.45 μm微膜過(guò)濾器過(guò)濾，濾液裝入棕色色譜瓶中進(jìn)行HPLC分析，分析條件為：色譜柱 Waters Nova-Pak-C18（3.9×150 mm，4 μm）；柱溫 30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm。流動(dòng)相A，異丙醇B，乙腈+水（體積比 80∶20）；梯度洗脫：100%B（0 min）→100%A（40 min）；柱流速0.5 mL/min；平衡時(shí)間6 min；進(jìn)樣量10 μL。采用比較標(biāo)樣保留時(shí)間法定性，外標(biāo)法定量。

1.3.3 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

2.1 不同基因型烤煙氮代謝關(guān)鍵酶活性變化

2.1.1 硝酸還原酶 從圖1可以看出，不同基因型烤煙品種 K326、紅花大金元葉片硝酸還原酶活性變化趨勢(shì)基本一致：在移栽后隨著生育進(jìn)程的推移，硝酸還原酶活性呈增加趨勢(shì)，在移栽后60 d時(shí)達(dá)到最大值，此后迅速下降。這表明生長(zhǎng)前期煙株氮代謝旺盛，對(duì)氮素的吸收、同化利用能力較強(qiáng)，有利于滿足煙株的生長(zhǎng)發(fā)育，進(jìn)入成熟期后硝酸還原酶活性下降，能夠促進(jìn)煙葉正常落黃成熟和內(nèi)在品質(zhì)的形成。同時(shí)，結(jié)果表明，在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，不同基因型烤煙品種葉片硝酸還原酶活性存在差異，在各個(gè)生育期均表現(xiàn)為紅花大金元>K326，表明紅花大金元的氮代謝能力較強(qiáng)。

圖1 不同基因型烤煙硝酸還原酶活性變化Fig.1 Activity change of nitrate reductase in different flue-cured tobacco cultivars

2.1.2 谷氨酰胺合成酶 圖2表明，整體上兩個(gè)不同基因型烤煙品種葉片谷氨酰胺合成酶活性在生育期內(nèi)的變化趨勢(shì)相同，即呈單峰曲線變化，在移栽后60 d時(shí)活性達(dá)到最大值，之后下降。在煙葉成熟期，谷氨酰胺合成酶活性較低，表明這個(gè)時(shí)期煙葉中氨同化代謝活動(dòng)已非常微弱。就不同烤煙品種而言，在整個(gè)生育期內(nèi)，紅花大金元谷氨酰胺合成酶活性均高于 K326，表明紅花大金元氨同化能力優(yōu)于K326。

圖2 不同基因型烤煙谷氨酰胺合成酶活性變化Fig.2 Activity change of glutamine synthetase in different flue-cured tobacco cultivars

2.2 不同基因型烤煙碳代謝關(guān)鍵酶活性變化

2.2.1 蔗糖轉(zhuǎn)化酶 圖3為不同基因型烤煙葉片蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性變化，結(jié)果顯示，整個(gè)生育期內(nèi)，不同基因型烤煙品種蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性變化趨勢(shì)一致，移栽后30～60 d時(shí)，蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性較低，呈緩慢增加趨勢(shì)；此后，迅速上升，在75 d時(shí)達(dá)到最大值，然后活性下降。這表明在葉片功能盛期，碳代謝活性較弱，主要以氮代謝為主；進(jìn)入葉片功能盛期，氮代謝減弱，以碳代謝為主。蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性較高，能夠促進(jìn)光合產(chǎn)物的合理分配，有利于形成優(yōu)質(zhì)煙葉。不同基因型間比較結(jié)果表明，紅花大金元葉片蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性高于 K326，表明紅花大金元對(duì)有機(jī)碳的固定能力較強(qiáng)。

圖3 不同基因型烤煙蔗移糖栽轉(zhuǎn)后化天數(shù)酶/d活性變化Fig.3 Activity change of invertase in different flue-cured tobacco cultivars

2.2.2 淀粉酶 從圖4可以看出，在移栽后30～45 d，煙葉淀粉酶活性處于較低的水平，隨著葉片的生長(zhǎng)發(fā)育和進(jìn)入現(xiàn)蕾期，淀粉酶活性迅速升高，在移栽后60 d時(shí)達(dá)到最大值，之后淀粉酶活性逐漸降低。表明在生長(zhǎng)前期淀粉在逐漸積累，但積累量較??；現(xiàn)蕾期淀粉積累迅速增多，進(jìn)入成熟期后淀粉由積累向分解轉(zhuǎn)化。就不同基因型間而言，紅花大金元葉片淀粉酶活性在整個(gè)生育期內(nèi)均高于K326，說(shuō)明紅花大金元葉片積累淀粉的能力較強(qiáng)，葉片淀粉含量較高。

圖4 不同基因型烤煙淀粉酶活性變化Fig.4 Activity change of amylase in different flue-cured tobacco cultivars

2.3 不同基因型烤煙類胡蘿卜素含量變化

煙葉類胡蘿卜素主要由 β-類胡蘿卜素、葉黃素、新黃質(zhì)和紫黃質(zhì)組成，對(duì)煙葉香氣貢獻(xiàn)率大[13]。從表1可以看出，隨著生育進(jìn)程的推移，類胡蘿卜素各組分含量均呈下降趨勢(shì)。β-類胡蘿卜素含量在前期降解速度較慢，在移栽60 d后下降明顯。新黃質(zhì)在30～45 d時(shí)迅速下降，而后，降解速度較慢，進(jìn)入成熟期，又呈明顯下降趨勢(shì)。紫黃質(zhì)含量在前期下降明顯，中后期呈緩慢下降趨勢(shì)。葉黃素在前期降幅較小，進(jìn)入成熟期后快速下降。類胡蘿卜素各組分中以 β-類胡蘿卜素含量最高，其次為葉黃素，新黃質(zhì)含量較低，而紫黃質(zhì)含量最少。同時(shí)，結(jié)果表明，在整個(gè)生育期內(nèi)，不同基因型烤煙品種類胡蘿卜素含量存在差異，β-類胡蘿卜素、葉黃素、新黃質(zhì)和紫黃質(zhì)均以紅花大金元含量較高。紅花大金元煙葉中類胡蘿卜素含量較高，表明煙葉類胡蘿卜素含量與基因型表現(xiàn)有關(guān)。

表1 不同基因型烤煙類胡蘿卜素含量變化 μg/gTable.1 Content change of carotenoids in different flue-cured tobacco cultivars

2.4 類胡蘿卜素含量與碳氮代謝關(guān)鍵酶活性的相關(guān)分析

相關(guān)分析結(jié)果表明（表2），類胡蘿卜素各組分間均呈極顯著（P<0.01）正相關(guān)關(guān)系。β-類胡蘿卜素、新黃質(zhì)、葉黃素和紫黃質(zhì)與硝酸還原酶、谷氨酰胺合成酶、淀粉酶活性均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，但相關(guān)關(guān)系不顯著（P>0.05），但β-類胡蘿卜素、新黃質(zhì)、葉黃素和紫黃質(zhì)均與蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P<0.05），表明蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性較高不利于煙葉生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中類胡蘿卜素的合成、積累。

表2 烤煙類胡蘿卜素含量與碳氮代謝關(guān)鍵酶活性的簡(jiǎn)單相關(guān)系數(shù)Table2 Pearson correlation coefficients between carotenoids contents and key enzyme activities involved in carbon and nitrogen metabolism

注: *表示0.05顯著水平，**表示0.01極顯著水平。

3 討 論

試驗(yàn)結(jié)果表明，在煙草生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，氮代謝關(guān)鍵酶硝酸還原酶、谷氨酰胺合成酶和碳代謝關(guān)鍵酶蔗糖轉(zhuǎn)化酶、淀粉酶變化規(guī)律基本一致，即四種酶活性在葉片功能盛期均呈增加趨勢(shì)，進(jìn)入成熟期，硝酸還原酶、谷氨酰胺合成酶活性迅速下降，而蔗糖轉(zhuǎn)化酶、淀粉酶在達(dá)到峰值后也呈下降趨勢(shì)，但降幅較小，葉片以碳代謝活動(dòng)為主。這與以往的研究結(jié)論基本一致[14]。同時(shí)，研究表明，不同基因型烤煙品種間葉片碳氮代謝關(guān)鍵酶活性也存在明顯差異，紅花大金元葉片硝酸還原酶、谷氨酰胺合成酶、蔗糖轉(zhuǎn)化酶以及淀粉酶活性全生育期均高于 K326，說(shuō)明紅花大金元碳氮代謝活動(dòng)旺盛，這可能是紅花大金元內(nèi)在品質(zhì)良好的重要原因。

類胡蘿卜素是煙草香氣的重要前體物，與香氣量、香氣質(zhì)成正相關(guān)關(guān)系[15]。本文研究發(fā)現(xiàn)，在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，紅花大金元葉片中類胡蘿卜素各組分β-類胡蘿卜素、新黃質(zhì)、葉黃素和紫黃質(zhì)含量均高于 K326，這與楊紅旗、張樹(shù)堂的研究結(jié)果相一致[16-17]。在同一生態(tài)條件和種植管理方式下，紅花大金元葉片中類胡蘿卜素含量較高，這可能是紅花大金元煙葉香氣質(zhì)好的原因之一。過(guò)偉民研究了我國(guó)六個(gè)主栽品種的類胡蘿卜素含量，發(fā)現(xiàn)不同品種葉片類胡蘿卜含量存在明顯差異，中煙100中部葉片中紫黃質(zhì)、葉黃素、β-類胡蘿卜素和總類胡蘿卜素含量均顯著高于其它品種[18]。這與本文結(jié)果相似，表明煙葉中類胡蘿卜素含量存在基因型差異；基因型不同，煙株對(duì)類胡蘿卜素的合成和降解能力不同，導(dǎo)致葉片內(nèi)類胡蘿卜素各組分含量存在差異。品種是決定烤煙中類胡蘿卜素合成、積累的的首要因素，因此，可以通過(guò)育種途徑選育類胡蘿卜素含量適宜的烤煙品種，從而提高煙葉品質(zhì)。

由類胡蘿卜素各組分含量與碳氮代謝關(guān)鍵酶相關(guān)分析結(jié)果可知，類胡蘿卜素各組分與硝酸還原酶、谷氨酰胺合成酶和淀粉酶呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，但相關(guān)性未達(dá)到顯著水平，表明硝酸還原酶、谷氨酰胺合成酶和淀粉酶對(duì)煙葉類胡蘿卜素含量影響不大。而β-類胡蘿卜素、新黃質(zhì)、葉黃素和紫黃質(zhì)均與蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明類胡蘿卜素在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的變化與碳氮代謝關(guān)鍵酶有一定的關(guān)聯(lián)性。蔗糖轉(zhuǎn)化酶對(duì)煙葉類胡蘿卜素合成、積累影響較大，可以通過(guò)調(diào)控蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性改善煙葉類胡蘿卜素含量，從而達(dá)到提高煙葉品質(zhì)的目的。

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