苗 圃，王海濤，李淑君，康業(yè)斌*

（1.河南科技大學(xué)林學(xué)院，河南 洛陽 471003；2.河南省煙草公司煙草研究所，河南 許昌 461000）

全國16個主產(chǎn)煙?。▍^(qū)）煙草侵染性病害62種，其中真菌性病害30種；河南省侵染性病害29種，其中真菌性病害14種[1]。此后又報到了煙草鐮刀菌根腐?。‵usarium solani）[2]、煙草叢頂?。═BTV、TVDV）[3]、煙草靶斑病（Thanatephorus cucumeris）[4]、煙草黑腳病（Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum strains）[5]等新病害。隨著煙草農(nóng)業(yè)不斷向規(guī)?；图s化方向發(fā)展，煙草種植不可避免的采用多年連作，導(dǎo)致土傳病害危害程度增加，老病害逐步加重，新病害相繼出現(xiàn)。筆者在此報道河南洛陽煙田發(fā)現(xiàn)的兩種煙草病害的病原菌鑒定結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 病原菌分離

2011年7月，河南省嵩縣煙草公司送檢的煙草病株，在莖的近土面處產(chǎn)生褐色水漬狀病斑，主根與支根出現(xiàn)褐色病斑，嚴重者呈水漬狀腐爛（圖1a），對病部進行常規(guī)組織分離，獲得Ⅰ號菌株。

2012年8月，在河南省洛寧縣煙田采集的煙草病株，病莖上出現(xiàn)不規(guī)則形灰白色病斑，邊緣清晰，其上密布不規(guī)則排列的小黑點（圖 2a），對病部進行常規(guī)組織分離，獲得Ⅱ號菌株。

1.2 形態(tài)學(xué)鑒定

圖1 莖黑腐病及其病原菌形態(tài)Fig.1 Tobacco Black Stem Rot and the pathogen

圖2 殼二孢莖枯病及其病原菌形態(tài)Fig.2 Ascochyta Stem Wilt disease and the pathogen

兩個菌株分別在燕麥培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～5 d后，用直徑5 mm的打孔器打取菌餅，轉(zhuǎn)接于燕麥及PDA平板中央，25 ℃光/暗（12 h/12 h）培養(yǎng)，7 d后觀察菌落特征，在顯微鏡下觀察并測量子實體大小。

1.3 分子生物學(xué)鑒定

刮取培養(yǎng)5～7 d的菌絲體50 mg，采用CTAB法[6-7]提取兩個病菌的基因組 DNA。利用通用引物ITS1和ITS4對所提取的DNA進行PCR擴增，反應(yīng)在25 μL反應(yīng)體系中進行。PCR反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5 min；進入循環(huán)，94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸105 s，30個循環(huán)；最后72 ℃補平10 min，4 ℃保存。取5 μL擴增產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠于1×TAE電泳緩沖液中電泳，用DNA Marker做對照，以凝膠成像系統(tǒng)檢測PCR擴增產(chǎn)物大小，觀察到合適的條帶后，將所對應(yīng)的原始擴增產(chǎn)物（未純化）40 μL寄往上海生工測序。

1.4 致病性測定

Ⅰ號菌株采用菌絲塊接種，選取健康的中煙100煙株，用滅菌的大頭針刺傷莖基部表皮，將菌絲塊貼于傷口，并用蘸取無菌水的脫脂棉包裹，25℃保濕培養(yǎng)。以瓊脂塊接種做對照。

Ⅱ號菌株采用孢子懸浮液針刺接種，制備孢子懸浮液并調(diào)整濃度為 1×106個/mL，選取健康的中煙100莖桿，用滅菌的大頭針刺傷莖部表皮，用脫脂棉蘸取孢子懸浮液并包裹在傷口處，25℃保濕培養(yǎng)。以無菌水接種做對照。

2 結(jié) 果

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

Ⅰ號菌株在燕麥培養(yǎng)基上菌落圓形，白色，長勢較快，呈放射型，并逐漸變?yōu)榛ò晷?，邊緣整齊，氣生菌絲稀?。▓D 1c）。部分老熟菌絲有分隔，菌絲直徑 1.8～3.9 μm，平均 2.7 μm（圖 1d）；孢子囊多球形，少數(shù)梨形，頂生或間生，直徑7.7～19.4 μm，平均14.0 μm（圖1e、圖1f）；雄器鐘狀或不規(guī)則，頂生，多同絲生；藏卵器球形，平滑，頂生，有時間生或切生，直徑 14～27 μm（平均 21.5 μm），每個藏卵器有一個雄器；卵孢子球形，不滿器（圖1g、圖1h、圖1i），根據(jù)以上形態(tài)學(xué)特征，將其鑒定為腐霉屬（Pythium sp.）。

Ⅱ號菌株在 PDA培養(yǎng)基上菌落初期白色，絨毛狀，邊緣整齊，菌落中部逐漸變?yōu)榍嗪谏?，邊緣白色（圖 2d）。分生孢子器極少，分生孢子卵圓形至梭形，無色，雙胞或單胞，雙胞大小 13.2～18.1 μm×2.6～7.7 μm，平均 14.2 μm×5.1 μm（圖 2e），單胞大小 3.1～9.8 μm×2.3～ 4.6 μm，平均 6.6 μm×2.9 μm（圖2f）。培養(yǎng)12～15 d產(chǎn)生子囊殼、子囊及子囊孢子，子囊殼極少（圖2-g），子囊棍棒狀，基部收縮呈短柄，大小 51.6～98.0 μm×7.7～11.6 μm，平均61.0 μm×9.1 μm（圖2h），子囊內(nèi)含8個子囊孢子，紡錘形，雙胞，上大下小，隔膜處有縊縮，大小 15.5～18.1 μm×5.2～8.3 μm，平均 16.4 μm×6.8 μm（圖 2I），根據(jù)以上形態(tài)學(xué)特征，將其無性時期鑒定為殼二孢屬（Ascochyta sp.），有性時期鑒定為Didymella sp.。

2.2 分子生物學(xué)鑒定

對Ⅰ號菌株進行rDNA-ITS序列測定，獲得有效序列長度609 bp，在GenBank上進行BLAST比對，并使用Clustal_X（1.83）軟件對自測序列以及從GenBank下載的相關(guān)序列進行較準（alignment）后，以距離法（Neighbor-joining法）[8]利用MEGA5軟件[9]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。結(jié)果表明，該序列與登錄號為 GU133578.1和 GU133597.1等的Pythium vexans（鐘器腐霉）親緣關(guān)系最近，ITS序列同源性99%。

對Ⅱ號菌株進行rDNA-ITS序列測定，獲得有效序列長度475 bp，在GenBank上進行BLAST比對，同上方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）。結(jié)果表明，該序列與登錄號為AY157876.1和AY157883.1等的Didymella ligulicola 親緣關(guān)系最近，ITS序列同源性100%。

2.3 致病性

Ⅰ號菌株菌絲塊接種5 d后，莖基部接種點呈深褐色，并逐漸向上下擴展（圖1b）。將發(fā)病部位做組織分離，重新獲得病原菌。

圖3 Ⅰ號菌株與GenBank上的相關(guān)序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of the strain I and correlation sequences

圖4 Ⅱ號菌株與GenBank上的相關(guān)序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of the strain II and correlation sequences

Ⅱ號菌株孢子懸浮液針刺接種7 d后，在針刺周圍可見突出于表皮的斑點，并逐漸突破表皮而外露，形成不規(guī)則排列的小黑點（圖2b、圖2c）。挑取小黑點在PDA上培養(yǎng)，重新獲得病原菌。

3 討 論

鐘器腐霉（Pythium vexans）屬鞭毛菌亞門（Mastigomycotina）藻菌綱（Phycomycetes），霜霉目（Peronosporales），霜霉科（Pythiaceae），腐霉屬（Pythium）。目前全世界報道的腐霉有200多種，其中超過 80種為植物重要的病原菌，危害多種作物，引起猝倒、根腐和莖腐等癥狀，如瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）、德巴利腐霉（Pythium debaryanum）和終極腐霉（Pythium ultimum）均能侵染煙草引起猝倒病[10]。鐘器腐霉在馬來西亞、印尼、印度、日本、巴西、英國、美國等 27個國家或地區(qū)廣泛分布[11-12]，在我國云南、海南、廣西、寧夏、北京和陜西等地均有報道[13]，能危害馬鈴薯、山藥、蔬菜和茶葉等 50種以上的經(jīng)濟作物，而在河南省危害煙草尚屬首次報道。

菊花疫病菌（Didymella ligulicola, 同物異名：Mycosphaerella ligulicola）屬子囊菌亞門（Ascomycotina），子囊菌綱（Ascomycetes），座囊菌目（Dothideales），座囊菌科（Dothideaceae），球腔菌屬（Mycosphaerella）；無性時期為菊花殼二孢（Ascochyta chrysanthemi），屬半知菌亞門（Deuteromycotina），球殼孢目（Sphaeropsidales），球殼孢科（Sphaeropsidaceae），殼二孢屬（Ascochyta）[14]。殼二孢屬在世界上分布廣泛，寄主范圍廣，種類繁多，目前全世界報道的殼二孢種類超過 1400種，多數(shù)為農(nóng)作物等的病原菌[15]，其中煙草殼二孢（Ascochyta nicotianae）危害煙草引起破爛葉病，該菌最早發(fā)現(xiàn)于意大利帕爾馬地區(qū)，高加索地區(qū)、法國、奧地利、德國、丹麥和美國等都有發(fā)生[16]，我國分布也較廣。國外報道菊花殼二孢首要寄主為菊花，人工接種可侵染大麗花、洋薊、萵苣、太陽花等多種園藝植物[17]，我國福建、浙江和河北等地也有該菌侵染菊花引起菊花花腐病的報道[18]，而菊花殼二孢侵染煙草屬首次報道，作者將該菌為害煙草引起的病害命名為煙草殼二孢莖枯病。

4 結(jié) 論

根據(jù)兩個菌株的形態(tài)特征和DNA序列測定比對結(jié)果，并參考國內(nèi)外文獻資料，將Ⅰ號菌株鑒定為鐘器腐霉（Pythium vexans de Bary），該病菌可引起煙草猝倒病。將Ⅱ號菌株有性時期鑒定為為菊花疫病菌[Didymella ligulicola（K.F.Baker, Dimock&L.H.Davis）von Arx]，同物異名菊花花腐病菌(Mycosphaerella ligulicola K.F.Baker)，無性時期為菊花殼二孢（Ascochyta chrysanthemi F.L.Stev.），該病菌引起煙草的一種新病害——殼二孢莖枯病。

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