吳焱秋 柴家科 張海龍 耿祎楠

[摘要]目的：通過(guò)檢測(cè)燒傷大鼠不同骨骼肌組織中凋亡相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄變化，探討細(xì)胞凋亡對(duì)燒傷后骨骼肌高消耗的影響機(jī)制。方法：180只大鼠隨機(jī)分為5組，通過(guò)建立大鼠燒傷模型，分別在燒傷后6h、1天、3天、7天及14天切取大鼠伸趾長(zhǎng)肌和比目魚(yú)肌，采用RT-PCR方法測(cè)定骨骼肌組織Akt、Bcl-2、Caspase-3的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。結(jié)果：伸趾長(zhǎng)肌Akt轉(zhuǎn)錄表達(dá)在傷后前期變化不明顯，在第14天顯著下降；Bcl-2轉(zhuǎn)錄表達(dá)在初期輕度上升，在后期下降；Caspase-3轉(zhuǎn)錄表達(dá)在傷后第7天和第14天顯著增高。比目魚(yú)肌Akt轉(zhuǎn)錄表達(dá)在燒傷后6h、1天、4天、7天無(wú)明顯變化，在燒傷后14天顯著下降；Bcl-2轉(zhuǎn)錄表達(dá)在燒傷后6h、1天和4天呈逐漸表達(dá)顯著增強(qiáng)趨勢(shì)，而后逐漸下降，；Caspase-3轉(zhuǎn)錄表達(dá)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)無(wú)顯著變化。結(jié)論：在嚴(yán)重?zé)齻笫?，快白肌組織凋亡明顯，而且隨著病程的延長(zhǎng)，凋亡越顯著；慢紅肌組織凋亡不明顯，盡管隨著病程的延續(xù)，有上升的趨勢(shì)。

[關(guān)鍵詞]燒傷；骨骼??；凋亡

[中圖分類號(hào)]Q591.2[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455（2014）08-0633-03

The transcriptional changes in apoptosis-related proteins in different types of skeletal muscle in burned rats

WU Yan-qiu,CHAI Jia-ke，ZHANG Hai-long，GENG Yi-nan

(Burns Institute,The First Affiliated Hospital to the General Hospital of PLA, Beijing 100048, China)

Abstract:ObjectiveBy detecting the transcriptional changes in apoptosis-related proteins in different types of skeletal muscle in burned rats, the influence mechanism of apoptosis on the skeletal muscle wasting was studied.Methods180 rats were randomly divided into 5 groups. By setting up the rat burned model, extensor digital longus muscle and soleus muscle samples were collected at 6h,1d,4d,7d and 14d after burn injury. Transcriptal expression of Ake, Bcl-2 and caspase-3 were measured by RT-PCR method. Results In extensor digital longus muscle, the Akt expression decreased significantly at different time points. The Bcl-2 expression increased slightly at early stage,but decreased at late stage.Caspase-3 expression increased significantly on days 7 and 14 postburn. While in soleus muscle,there were no significant changes in Akt expression at other time points except significant decrease on day 14. There were significant increases in Bcl-2 at 6h,1d and 4d, and the decrease gradually on days 7 and 14 postburn. There were no marked changes in caspase-3 expression. Conclusion In severely burned rats, apoptosis could commonly occur in fast-white skeletal muscle,and become markedly along with the prolongation of the disease course, with no obvious change in slow-red skeletal muscle.

Key words: burn injury; skeletal muscle;apoptosis大面積深度燒傷對(duì)全身的影響極為劇烈，骨骼肌作為人體最大的含氮組織，在嚴(yán)重?zé)齻麜r(shí)會(huì)發(fā)生明顯萎縮，因此是燒傷時(shí)機(jī)體蛋白質(zhì)喪失的主要來(lái)源[1]。骨骼肌蛋白大量丟失危害甚大，因此，弄清燒傷時(shí)骨骼肌萎縮的機(jī)制，并采取有效措施進(jìn)行干預(yù)或調(diào)控，對(duì)糾正燒傷代謝紊亂，提高患者生存率，具有重要指導(dǎo)意義[2]。本研究采用大鼠燒傷模型，測(cè)定骨骼肌組織中凋亡相關(guān)成分的表達(dá)變化，為臨床干預(yù)或調(diào)控骨骼肌萎縮和肌肉蛋白高消耗提供新的依據(jù)。

1材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性Wistar大鼠180只，由中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供，體重60～70g，動(dòng)物購(gòu)進(jìn)后本單位動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)性喂養(yǎng)一周以上。

1.2 試劑：GoldViewTM核酸染料（賽百盛公司）；總RNA提取試劑盒（美國(guó)Life Technology公司）；AMV反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Promega公司）；Taq DNA聚合酶（美國(guó)Promega公司）；PCR Marker（賽百盛公司）；dNTPs（美國(guó)Promega公司）；TAE電泳緩沖液（北京鼎國(guó)公司）；瓊脂糖（美國(guó)Promega公司）；溴酚藍(lán)（美國(guó)Sigma公司）；二甲苯青FF（美國(guó)Sigma公司）焦碳酸二乙酯（美國(guó)Promega公司）；TAE電泳緩沖液。

相關(guān)引物序列（北京賽百盛生物工程技術(shù)公司提供）：

大鼠Akt：擴(kuò)增長(zhǎng)度720bp

5'--ACA,GAC,GGC,TCA,TTC,ATA,GG-3'，5'--CTC,GGT,ACA,CAA,TCT,TTC,CAG-3';

大鼠Bcl-2：擴(kuò)增長(zhǎng)度481bp

5'--TCG,TGA,TGA,AGT,ACA,TCC-3'，

5'--CAT,CCA,CAG,AGC,GAT,GTT-3'；

大鼠Caspase-3：擴(kuò)增長(zhǎng)度655bp

5'--CCT,ATT,CAC,ACA,CAC,ACT,CC-3'，

5'--CAT,CCC,ATC,TCT,TTC,TTT,CC-3';

大鼠三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)：擴(kuò)增長(zhǎng)度309bp[3]

5'--TCC,CTC,AAG,ATT,GTC,AGC,AA-3'，

5'--AGA,TCC,ACA,ACG,GAT,ACA,TT-3'。1.3 制作燒傷動(dòng)物模型：試驗(yàn)前12h禁食，自由飲水。復(fù)方氯胺酮（0.1mg/kg）腹腔注射麻醉，脫毛器背部體側(cè)脫毛。麻醉滿意后，100℃沸水持續(xù)12s，造成大鼠背部30%Ⅲ度燙傷（以下簡(jiǎn)稱燒傷），燒傷深度經(jīng)病理證實(shí)。立即腹腔注射生理鹽水40ml/kg復(fù)蘇。將大鼠置于代謝籠觀察。

1.4 動(dòng)物分組：隨機(jī)分成5組，分別為處理后6h、1天、3天、7天及14天組，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)正常對(duì)照12只，燒傷大鼠每個(gè)時(shí)間點(diǎn)24只，活殺取材。

1.5 標(biāo)本采集及處理：嚴(yán)格無(wú)菌、無(wú)創(chuàng)游離大鼠伸趾長(zhǎng)肌和比目魚(yú)肌，新鮮標(biāo)本分別進(jìn)行骨骼肌充氧離體孵育、液氮保存和4%多聚甲醛固定。孵育液體-70℃冰箱保存。

1.6觀察指標(biāo)：本研究采用RT-PCR方法測(cè)定骨骼肌組織Akt、Bcl-2、Caspase-3轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)變化。三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）為穩(wěn)定表達(dá)的看家基因，被選擇作用內(nèi)參，以目的基因與內(nèi)參對(duì)照表達(dá)間的比值反映目的基因表達(dá)的相對(duì)含量。結(jié)果采用Alpha Innotech Corporation公司的Alpha Easy FC軟件進(jìn)行圖像分析。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所有數(shù)據(jù)均以x±s表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS12.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異非常顯著。

2結(jié)果

2.1 大鼠燒傷后伸趾長(zhǎng)肌組織中Akt轉(zhuǎn)錄表達(dá)在正常對(duì)照組即有高表達(dá)，燒傷后6h略有下降，燒傷后1天表達(dá)顯著下降，燒傷后4天出現(xiàn)回升，7和14天變化不明顯，整體趨勢(shì)呈顯著下降，除6h組外，其他組和正常對(duì)照相比下降顯著(圖1)。

2.2 燒傷后伸趾長(zhǎng)肌組織中的Bcl-2轉(zhuǎn)錄表達(dá)在正常對(duì)照組可見(jiàn)表達(dá)，燒傷后6h輕度升高，燒傷后1天變化不明顯，燒傷后4天表達(dá)顯著升高，7和14天略有下降，但與正常對(duì)照相比仍顯著增加（圖2）。

2.3 燒傷后伸趾長(zhǎng)肌組織中的Caspase-3轉(zhuǎn)錄表達(dá)在正常對(duì)照組輕度表達(dá)，6h、1天、4天輕度升高，7和14天顯著升高，基本上呈逐漸上升趨勢(shì)（圖3）。

2.4 燒傷后比目魚(yú)肌組織中Akt轉(zhuǎn)錄表達(dá)在正常對(duì)照組輕度表達(dá)，燒傷后6h、1天、4天、7天與正常對(duì)照組相比變化不明顯，在燒傷后14天下降明顯，與正常對(duì)照組相比下降有顯著差異（圖4）。

2.5 燒傷后比目魚(yú)肌組織中Bcl-2轉(zhuǎn)錄表達(dá)在正常對(duì)照組輕度表達(dá)，而后在燒傷后6h、1天和4天組呈逐漸表達(dá)顯著增強(qiáng)趨勢(shì)，而后逐漸下降，至燒傷后14天下降到低谷，各組相比差異不顯著（圖5）。

2.6 燒傷后比目魚(yú)肌組織中Caspase-3轉(zhuǎn)錄表達(dá)在正常對(duì)照組輕度表達(dá)，在燒傷后6h、1天、4天、7天和14天各個(gè)時(shí)間點(diǎn)無(wú)顯著變化（圖6）。

3討論

臨床上關(guān)于燒傷的代謝和營(yíng)養(yǎng)問(wèn)題一直貫穿其治療過(guò)程的始終。骨骼肌含有機(jī)體蛋白總干重的55%～60%，是機(jī)體最大的含氮庫(kù)。在燒傷時(shí)，骨骼肌組織發(fā)生顯著的消耗和萎縮，導(dǎo)致機(jī)體不僅出現(xiàn)嚴(yán)重的低蛋白血癥，而且伴有嚴(yán)重的負(fù)氮平衡。這些變化非常不利于患者創(chuàng)面的愈合，患者抵御感染的能力也明顯下降，結(jié)果進(jìn)一步加重患者的病情，因此闡明燒傷時(shí)骨骼肌消耗和萎縮的機(jī)制具有重要的臨床意義。國(guó)外已有研究表明[4]，在生物體發(fā)育過(guò)程中，存在肌肉凋亡現(xiàn)象，導(dǎo)致收縮功能的喪失。但有關(guān)燒傷時(shí)骨骼肌細(xì)胞消耗和凋亡之間的關(guān)系仍需進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果顯示，在燒傷刺激后，伸趾長(zhǎng)肌組織中Akt轉(zhuǎn)錄表達(dá)在正常對(duì)照組即有高表達(dá)，整體趨勢(shì)呈顯著下降，而且與對(duì)照組相比有顯著差異。由于Akt參與抗凋亡作用，它的表達(dá)降低表明燒傷后伸趾長(zhǎng)肌組織抗凋亡作用減弱，其結(jié)果可能導(dǎo)致肌肉凋亡的增強(qiáng)。

Bcl-2表達(dá)在燒傷后6h輕度升高，說(shuō)明機(jī)體抗凋亡作用輕度降低，在燒傷后4天出現(xiàn)顯著升高，可能主要由于應(yīng)激的刺激，機(jī)體反應(yīng)性增加抗凋亡作用[5]。但在燒傷后7和14天組又出現(xiàn)下降趨勢(shì)，且傷后14天組較正常對(duì)照組顯著降低，表明燒傷早期機(jī)體可能對(duì)伸趾長(zhǎng)肌組織蛋白降解具有抵抗作用，為了保證肌肉組織的完整性，防止肌肉細(xì)胞發(fā)生凋亡；但是隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，可能還有燒傷創(chuàng)面的感染，無(wú)法繼續(xù)防止肌肉萎縮的發(fā)生，結(jié)果任其消耗。

燒傷后伸趾長(zhǎng)肌組織中Caspase 3轉(zhuǎn)錄表達(dá)變化呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢(shì)。由于caspase 3是參與凋亡的主要效應(yīng)酶，其升高表明組織凋亡比較活躍[6]，早期可能由于機(jī)體抗凋亡信號(hào)比較活躍，表達(dá)不是很高；后期由于抗凋亡系統(tǒng)逐漸衰弱，促進(jìn)凋亡的信號(hào)增強(qiáng)，從而在燒傷后期高表達(dá)，刺激伸趾長(zhǎng)肌組織發(fā)生凋亡，進(jìn)而促進(jìn)肌肉組織的消耗和萎縮。

比目魚(yú)肌屬于慢紅肌纖維，在燒傷大鼠比目魚(yú)肌組織中，Akt轉(zhuǎn)錄表達(dá)早期無(wú)明顯變化，但在傷后14天組下降明顯。說(shuō)明隨著燒傷時(shí)間延長(zhǎng)，慢紅肌纖維也出現(xiàn)抗凋亡作用減弱。其Bcl-2的轉(zhuǎn)錄表達(dá)基本和Akt表達(dá)相似，但是降低時(shí)間較Akt提前，表明比目魚(yú)肌組織早期均有抵抗肌肉萎縮和消耗的作用，在燒傷后期均出現(xiàn)抗凋亡作用乏力。其caspase 3的轉(zhuǎn)錄表達(dá)沒(méi)有發(fā)生顯著的變化，但在燒傷后期有逐漸上升的趨勢(shì)，表明在燒傷大鼠比目魚(yú)肌組織中發(fā)生凋亡的可能性明顯增大。

根據(jù)上述研究，可以推斷，在嚴(yán)重?zé)齻笫螅彀准〗M織凋亡明顯，而且隨著病程的延長(zhǎng)，凋亡越顯著；慢紅肌組織凋亡不明顯，盡管隨著病程的延續(xù)，有上升的趨勢(shì)。

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[收稿日期]2010-11-23[修回日期]2014-04-11

編輯/張惠娟