鐘興業(yè)，楊志偉，李全陽，覃 慧，符雅慧，孫 艷

（廣西大學輕工與食品工程學院，廣西南寧530004）

固定化中性蛋白酶制備水牛乳抗氧化活性肽的研究

鐘興業(yè)，楊志偉*，李全陽*，覃 慧，符雅慧，孫 艷

（廣西大學輕工與食品工程學院，廣西南寧530004）

采用瓊脂包埋固定中性蛋白酶，優(yōu)化固定化條件，并利用固定化酶水解脫脂水牛乳生產(chǎn)具有抗氧化活性的酶解液，對其進行調(diào)配研制具有抗氧化活性的飲料。結果表明，最佳固定化條件為3%的瓊脂、每克瓊脂添加160mg中性蛋白酶、固定化時間為4h。固定化酶水解脫脂水牛乳最佳工藝為pH7.5、溫度55℃、加酶量為2500U/g和酶解5h。

水牛乳，固定化酶，抗氧化活性

近來研究發(fā)現(xiàn)自由基引起大分子物質（如DNA、蛋白質、碳水化合物，脂類和核酸等）的變性、交聯(lián)、斷裂等氧化傷害，進而導致細胞結構和功能的破壞以及機體組織的損傷和器官的病變，從而引發(fā)各種疾病、癌變、老化等[1]。當體內(nèi)的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）等內(nèi)源性抗氧化酶無法維持體內(nèi)自由基代謝平衡時，可以適當補充外源性抗氧化劑，從而提高機體抗氧化水平，維持體內(nèi)氧化還原平衡，抵御自由基損害，幫助機體抵御疾病[2-5]。J.Pedroche等[6]利用瓊脂糖包埋固定消化蛋白酶水解油菜芥蛋白得到具有抗氧化活性的水解物，為研究外源性抗氧化劑做準備。本研究利用瓊脂固定中性蛋白酶水解水牛乳制備具有抗氧化活性的水牛乳蛋白肽，以DPPH自由基清除率指示抗氧化活性，其中DPPH自由基是一種穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，含有3個苯環(huán)，其中1個氮原子上有1個孤對電子，在517nm處有強吸收，抗氧化劑與DPPH自由基的孤對電子配對進而將吸收消失或減弱，通過計算EC50、TEC50（清除DPPH自由基50%時所用的時間）和AE（清除效率）等參數(shù)來反映抗氧化劑清除自由基的能力[7]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮水牛奶 白沙市場；中性蛋白酶 Solarbio公司；二苯代苦味?；杂苫―PPH） Sigma公司；其他試劑 均為分析純，由威佳試劑公司供應。

PB-10酸度計 Sartorius公司；UV5200紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；JRA-2數(shù)顯磁力攪拌水浴鍋 江蘇省金壇市科杰儀器廠；LG10-2.4A離心機 北京醫(yī)用離心機廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 瓊脂固定中性蛋白酶[8]將瓊脂粉煮沸溶解，置于55℃水浴，待溫度恒定后加入酶液充分混勻，配制30m L 1%～5%的瓊脂固定化酶液，并置于4℃冰箱中靜置硬化1～6h。待瓊脂冷凝后取出切成約2～4mm的小方塊，用蒸餾水充分洗滌固定化酶，用吸水紙吸干表面水分，干燥后貯存于4℃冰箱中備用。

1.2.2 酶活力的測定[9]取酶液lm L（固定化酶0.2g），用0.02mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.2）稀釋2000倍，取

1m L分別置于0、1、2、3號試管中，（0號試管再加入2m L，10%-三氯乙酸）于40℃水浴中預熱3～5m in，加入預熱（40℃）的2%干酪素1m L準確保溫15m in后。加入10%三氯乙酸2m L（1、2、3號試管），四支管過濾除去沉淀，取清液1m L，加入0.55mol/L碳酸鈉5m L，再加入福林-酚試劑1m L，于40℃水浴中顯色15m in，在680nm波長比色，測OD680，以0號管為空白。固定化酶活力回收率（%）=。

1.2.3 水牛乳的脫脂 采用離心法對新鮮水牛乳進行脫脂，離心條件為：4℃下8000r/m in，離心10m in，離心后去掉上層脂肪。將脫脂水牛乳于冰箱中冷凍保藏備用。

1.2.4 固定化中性蛋白酶對脫脂水牛乳的酶解[10]取出冷凍脫脂水牛乳，50℃熱水中解凍，用量筒量取100m L，加入100m L蒸餾水，置于500m L具塞三角瓶中，90℃預熱處理5m in；取出冷卻至固定化中性蛋白酶的最適反應溫度，調(diào)節(jié)pH至固定化中性蛋白酶的最適值。置于磁力攪拌水浴鍋上，在最適溫度下，加入對固定化酶啟動水解反應。反應過程用酸度計監(jiān)控，以1mol/L的NaOH或HCl溶液維持pH恒定在其最適pH，記錄水解過程中所消耗的NaOH或HCl溶液的量。水解至預定時間后，用紗布濾出固定化酶，酶解液調(diào)至pH 7.0，以8000r/m in離心10m in，取上清液進行測定。1.2.4.1 單因素實驗 以水解度和DPPH自由基清除率為指標，考察pH（6.5、7.0、7.5、8.0、8.5）、溫度（45、50、55、60、65℃）、酶解時間（1、2、3、4、5、6h）以及加酶量（1000、1500、2000、2500、3000U/g）對酶解效果的影響。每個處理做3個重復實驗。

1.2.4.2 酶解正交實驗 分析單因素實驗結果，選擇酶解溫度、pH、加酶量和酶解時間為因素，以DPPH自由基清除率為指標進行4因素3水平的正交實驗。

表1 酶解正交實驗因素水平表Table 1 Enzymatic orthogonal factor level table

式中：htot：單位質量蛋白質中肽鍵的總量（mmoL-1）；V：水解過程中所消耗的堿量（m L）；Nb：堿液的濃度（mol·L-1）；Mp：酶解液中蛋白質的質量（g）；α：α-氨基的平均解離度。

1.2.6 酶解產(chǎn)物清除DPPH自由基活性的測定[12]配制濃度為2×10-4mol·L-1DPPH無水乙醇溶液，避光保存。取2m L樣品與2m L DPPH無水乙醇溶液混合，并劇烈振蕩，在室溫下避光反應30m in，然后在517nm處測定其吸光值Ai?？瞻捉M以等體積無水乙醇溶液替

1.2.5 水解度的測定[11]pH-stat法，水解度（DH）根據(jù)消耗的NaOH的量表示，按下式進行計算：代DPPH溶液，對照組以等體積蒸餾水替代樣品溶液。DPPH自由基清除率用下式計算：

式中：A0—對照組吸光度；Ai—樣品組吸光度；Aj—空白組吸光度。

1.3 統(tǒng)計分析

所有測試結果共進行三次重復，數(shù)據(jù)表示為平均值±標準誤差。統(tǒng)計分析是采用SPSS17.0軟件和m icrosoft Excel 2010。95%置信區(qū)間（p＜0.05）被確定為顯著差異。

2 結果與討論

2.1 瓊脂固定化酶實驗結果

2.1.1 瓊脂濃度對固定化酶的影響 瓊脂為親水性膠體，分有條狀和粉末狀，不溶于冷水，易溶于熱水，利用其凝固性、穩(wěn)定性，能與蛋白酶形成絡合物等物理化學性質，制備瓊脂固定化酶。以120mg的中性蛋白酶和1g瓊脂調(diào)配成不同瓊脂濃度的瓊脂與酶混合液，在4℃下硬化3h制成固定中性蛋白酶，測定其單位酶活力，計算出酶活力回收率，結果如表2所示。

表2 不同瓊脂濃度的固定化酶特性和酶活力回收率Table 2 Property and activity recovery of immobilized enzymeunder different concentrations of agar

從表2可以看出，瓊脂濃度為1%或2%，固定化酶凝膠較稀、網(wǎng)孔較大，質地較軟，經(jīng)蒸餾水沖洗后，中性蛋白酶損失較多，故酶活力回收率僅為16.23%和25.58%；而太高的瓊脂含量又會導致固定化酶包埋致密、網(wǎng)孔太小，使底物向內(nèi)擴散和產(chǎn)物向外擴散變得困難，導致底物缺乏和產(chǎn)物抑制，使固定化酶活力回收率下降，如瓊脂濃度為5%時，固定化酶酶活力回收率僅為27.35%。所以最佳瓊脂的質量分數(shù)為3%。

2.1.2 加酶量對固定化酶的影響 按要求取不同質量的中性蛋白酶和1g瓊脂調(diào)配成3%瓊脂濃度的瓊脂與酶混合液，在4℃下硬化3h，制成固定化酶，測定其單位酶活力，計算出酶活力回收率，結果如圖1所示。

隨著加酶量的增長，固定化酶酶活力回收率先增大然后減小，當每克瓊脂載體添加160mg中性蛋白酶時，酶活力回收率達到最大。這是因為過少的酶液會導致瓊脂載體無法飽和吸附，造成載體的浪費；而過多的酶液加入，造成吸附在載體孔道內(nèi)部的酶蛋白擴散阻力的增大，酶活力無法表現(xiàn)出來[13]。故選擇每克瓊脂添加160mg中性蛋白酶。

2.1.3 靜置時間對固定化酶的影響 以120mg的中性蛋白酶和1g瓊脂調(diào)配成3%瓊脂濃度的瓊脂與酶

的混合液，在4℃下硬化不同的時間，并測定固定化酶活性，以最大活性值為100%，計算各相對酶活力，結果見圖2。

圖1 不同加酶量的固定化酶酶活力回收率Fig.1 Activity recovery of immobilized enzyme under different adjunction of enzymes

圖2 不同靜置時間的相對酶活力Fig.2 Relative activity of immobilized enzyme under different standing time

固定化時間在1～4h時，固定化酶單位酶活力逐漸增大，但硬化超過4h后，隨著時間的延長，固定化酶單位酶活力逐步下降。這是因為瓊脂硬化后能夠很好地形成凝膠，但如果固定化時間太長，形成的凝膠結構太緊密，會影響到酶促反應速率，固定化酶單位酶活力就會下降。故瓊脂固定化時間選擇為4h。在最優(yōu)固定化條件下，得到的固定化中性蛋白酶酶活力回收率為40%。

2.2 固定化酶酶解脫脂乳單因素實驗結果

2.2.1 溫度對固定化酶酶解脫脂乳的影響 取等量脫脂水牛乳，按2000U/g添加固定化酶，按要求調(diào)節(jié)不同溫度，在pH 7.0條件下酶解4h，溫度對瓊脂固定中性蛋白酶水解脫脂水牛乳的影響如圖3所示。

從圖3可以看出，隨著反應溫度的增加，固定化酶水解脫脂水牛乳反應的水解度和水解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率都先增大再減小，反應溫度達到55℃時，水解度和DPPH自由基清除率都達到最大值，分別為30.68%、62.40%。55℃以后，反應溫度再增加，水解度和DPPH自由基清除率反而降低。因為酶促反應速率與溫度有關，存在最適反應溫度。在酶促反應的最初階段，水牛乳蛋白的變性還未表現(xiàn)出來，因此反應速率隨溫度升高而增加，水解度也隨之上升，抗氧化活性物質也越來越多；但高于最適溫度時，固定化酶變性逐漸突出，反應速率隨著溫度升高的效應將逐漸為固定化酶的變性效應所抵消，反應速率迅速下降，水解度也隨之下降，抗氧化物質也越來越少。因此選擇55℃作為瓊脂固定中性蛋白酶酶解脫脂水牛乳的最適反應溫度。

圖3 不同溫度條件下水解樣品的DPPH自由基清除率和水解度測定結果Fig.3 Results of degree of hydrolysis and DPPH radicalscavenging capacity of hydrolysis under different temperature

2.2.2 pH對固定化酶酶解脫脂乳的影響 取等量脫脂水牛乳，按2000U/g添加固定化酶，按要求調(diào)節(jié)不同pH，在55℃條件下酶解4h，pH對瓊脂固定中性蛋白酶水解脫脂水牛乳的影響如圖4所示。

圖4 不同pH條件下水解樣品的DPPH自由基清除率和水解度測定結果Fig.4 Results of degree of hydrolysis and DPPH radicalscavenging capacity of hydrolysis under different pH

從圖4可以看出，隨著反應液pH的增加，固定化酶水解脫脂水牛乳反應的水解度和水解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率都先增大再減小，pH達到7.5時，水解度和DPPH自由基清除率都達到最大值，分別為32.09%、61.95%。pH7.5以后，隨著反應液pH的增加，水解度和DPPH自由基清除率反而降低。綜合以上結果，當pH為7.5時，水解反應具有最大的水解度，且其酶解液具有最高DPPH自由基清除率，原因是酶促反應具有最適pH，不在最適pH條件下，會抑制固定化酶與底物的結合以及酶催化底物轉變成產(chǎn)物。因此選擇pH 7.5作為瓊脂固定中性蛋白酶酶解脫脂水牛乳的最適pH。

2.2.3 加酶量對固定化酶酶解脫脂乳的影響 取等量脫脂水牛乳，按要求添加固定化酶，在55℃，pH 7.0條件下酶解4h，加酶量對瓊脂固定中性蛋白酶水解

脫脂水牛乳的影響如圖5所示。

圖5 不同加酶量條件下水解樣品的DPPH自由基清除率和水解度測定結果Fig.5 Results of degree of hydrolysis and DPPH radicalscavenging capacity of hydrolysis under differentadjunction of enzymes

從圖5可以看出，隨著每克底物蛋白加酶量的增加，固定化酶水解脫脂水牛乳反應的水解度不斷的增加，當每克底物蛋白加酶量達到2000U以后，水解度無顯著增加（p＞0.05）。水解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率也隨每克底物蛋白加酶量的增加而增加，當每克底物蛋白加酶量達到2000U以后，DPPH自由基清除率無顯著增加（p＞0.05）。這說明在底物濃度不變的情況下，增加酶用量可以提高酶與底物的結合效率，但過量的酶分子抑制了中間產(chǎn)物向酶解反應終產(chǎn)物的轉化，造成水解程度增加變緩慢，DPPH自由基清除率也趨于平緩。故選擇每克蛋白加酶量為2000U。

2.2.4 酶解時間對固定化酶酶解脫脂乳的影響 取等量脫脂水牛乳，按2000U/g添加固定化酶，在55℃，pH7.0條件下酶解不同時間，酶解時間對瓊脂固定中性蛋白酶水解脫脂水牛乳的影響如圖6所示。

圖6 不同酶解時間水解樣品的DPPH自由基清除率和水解度測定結果Fig.6 Results of degree of hydrolysis and DPPH radicalscavenging capacity of hydrolysis under different hydrolysis time

從圖6可以看出，隨著水解時間的延長，固定化酶水解脫脂水牛乳反應的水解度不斷的增加，當水解5h以后，水解度無顯著增加（p＞0.05）。這是因為反應剛開始時，固定化酶與底物接觸充分，水解度不斷上升；反應一段時間后，底物變少，沒有充分的結合位點與固定化酶結合，故水解度增加趨向平緩。同時，水解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率也在水解5h的時候出現(xiàn)最大值達到62.63%，再延長反應時間，DPPH自由基清除率反而下降。這是因為反應5h以前，水解出抗氧化活性的物質多余抑制抗氧化活性的物質，但隨著反應時間的延長水解出抑制抗氧化活性的物質越來越多。所以選擇5h作為瓊脂固定中性蛋白酶酶解脫脂水牛乳的最適反應時間。

2.3 固定化酶酶解脫脂乳正交實驗

在單因素實驗的基礎上，選擇pH、溫度、加酶量和酶解時間為因素，以DPPH自由基清除率為指標選擇表L9（34），進行瓊脂固定化中性蛋白酶酶解脫脂水牛乳的正交實驗。結果如表3所示。

表3 固定化酶酶解脫脂乳正交實驗結果Table 3 Orthogonal results of hydrolysising skim milk by immobilized enzyme

從表3可知，影響水解產(chǎn)物DPPH自由基清除率的因素主次順序為A（pH）＞C（加酶量）＞B（溫度）＞D（酶解時間）。這是因為pH能有效抑制固定化酶與底物的結合以及酶催化底物轉變成產(chǎn)物，而固定化酶對溫度沒有游離酶那么靈敏，固定化酶對溫度有更強的耐受性，這結果與王君虹[14]和鹿波[15]的研究結果相同。最終確定最佳酶解條件為A2B2C3D2，即pH為7.5、溫度為55℃、加酶量為2500U/g和酶解5h，與單因素實驗結果一致。驗證實驗表明，在最佳工藝條件下，水解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率達到65.24%。

3 討論

前人研究主要集中在利用游離中性蛋白酶對水牛乳中乳清蛋白或酪蛋白進行酶解或者利用固定化酶對荷斯坦牛奶進行酶解調(diào)配，如同課題組的閉秋華等[16]利用中性蛋白酶對水牛乳中乳清蛋白進行酶解制備抗氧化活性肽，并優(yōu)化了酶解條件；Fidel Toldra等[17]利用多孔玻璃微珠固定豬組織蛋白酶水解荷斯坦牛乳中酪蛋白制備生物活性肽；謝慶武等[18]利用殼聚糖共價交聯(lián)固定中性蛋白酶水解荷斯坦牛乳中酪蛋白制備低苦味水解物。本文首次利用瓊脂固定中性蛋白酶對水牛乳進行酶解并優(yōu)化酶解條件，達到蛋白酶的重復多次利用，后面將以水牛乳酶解液進行調(diào)配得到色香味良好的水牛乳抗氧化活性飲料。

4 結論

瓊脂固定中性蛋白酶，得到酶活力回收率達到40%的固定化酶，并利用固定化酶對脫脂水牛乳進行酶解，最佳酶解工藝為pH 7.5、溫度55℃、加酶量為2500U/g和酶解5h，得到的水解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率達到65.24%。后續(xù)研究還要對抗氧化活性肽進行超濾、大孔樹脂脫鹽，葡聚糖凝膠G-15和反相高效液相過濾，最后經(jīng)過質譜得出具體的抗氧化肽分子量分布和氨基酸序列，且抗氧化活性肽的確定有待進一步研究。

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Study on preparation of antioxidant activity peptides of buffalo milk byimmobilized neutral protease

ZHONG Xing-ye，YANG Zhi-wei*，LIQuan-yang*，QIN Hui，F(xiàn)U Ya-hui，SUN Yan
（College of Light Industry and Food Engineering，GuangxiUniversity，Nanning 530004，China）

Skim buffalo milk was hydrolyzed by immobilized enzyme which neutral protease was fixed to Agar forproduction of antioxidant hydrolyzate. The condition of immobilization and hydrolysis was optimized. Theantioxidant hydrolyzate was deployed to develop antioxidant activity beverages. Consequently，the optimumimmobilization conditions was obtained as 3% of agar，adjunction of neutral protease 160mg/g，immobilizationtime of 4h. Optimal parameters immobilized that enzyme hydrolyzed skim buffalo milk was drawn as pH7.5，temperature 55℃，enzyme dosage of 2500U/g and hydrolysis time of 5h.

buffalo milk；immobilized enzymes；antioxidant activity

TS201.1

：A

：1002-0306（2014）16-0192-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.16.035

2013－11－07 *通訊聯(lián)系人

鐘興業(yè)（1988-），男，碩士研究生，研究方向：乳制品科學與技術。

廣西科學研究與技術開發(fā)計劃項目（桂科攻11107005-1D）。