趙 娜，馮 娜，賈 薇，馮 杰，劉艷芳，張勁松，*

（1.國家食用菌工程技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，上海201403；2.上海海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程，上海201306）

靈芝（Ganoderma lucidum）俗稱靈芝草，古稱瑞草、仙草、萬年覃等，是擔(dān)子菌綱多孔菌科靈芝屬真菌，具有很高的藥用價(jià)值[1]，現(xiàn)代的研究證實(shí)其有抗腫瘤、保肝、降血壓、降血糖等生物活性，三萜是靈芝產(chǎn)生抗腫瘤、保肝等生物活性的主要藥用成分[2-3]。目前，靈芝相關(guān)的保健品和藥品多以靈芝子實(shí)體為原料，但因其栽培周期長，靈芝中的活性成分的種類和含量如三萜易受栽培環(huán)境的變化而變化，導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量難以控制。而利用發(fā)酵的方法制備靈芝的菌絲體作為靈芝產(chǎn)品開發(fā)的原料，具有生產(chǎn)周期短，質(zhì)量容易控制，易于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，越來越得到業(yè)界的重視。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)靈芝酸T、靈芝酸S和靈芝酸R是靈芝菌絲體中主要的三萜成分，其具有抗肝癌[4]、抗子宮頸癌[5]、抗前列腺癌的作用。因此建立靈芝菌絲體中主要三萜成分的測(cè)定方法對(duì)開發(fā)靈芝菌絲體的產(chǎn)品就至關(guān)重要。靈芝子實(shí)體中三萜類化合物的液相色譜分析已有報(bào)道[6-7]，但涉及菌絲體中三萜成分檢測(cè)方法和質(zhì)量控制的很少有報(bào)道。本研究以已報(bào)道的關(guān)于靈芝酸的相關(guān)檢測(cè)方法為基礎(chǔ)[8-10]，建立了HPLC法對(duì)靈芝菌絲體中靈芝酸T、靈芝酸S和靈芝酸R進(jìn)行同時(shí)測(cè)定的方法，為快速準(zhǔn)確的檢測(cè)靈芝發(fā)酵菌絲體中靈芝酸含量提供了技術(shù)保證。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

靈芝酸T、S、R標(biāo)準(zhǔn)品 純度＞98%，上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌所深加工技術(shù)和發(fā)酵工程研究室；赤芝0125菌絲體、靈芝119菌絲體、靈芝G0023菌絲體中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)農(nóng)業(yè)微生物中心上海食用菌分中心；水 超純水；甲醇 色譜純；冰醋酸 分析純。

Waters Acquity HPLCTM型高效液相色譜儀 美國Waters公司；KQ-600B型超聲清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；超純水器 ELGA公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件 YMC C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相0.5%冰醋酸溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～20min，85%B→100%B；20～30min，100%B），流速為1mL/min；檢測(cè)波長為245nm；柱溫控制在30℃；進(jìn)樣量為10μL。

1.2.2 樣品前處理?xiàng)l件選擇

1.2.2.1 提取溶劑的選擇 精密稱取樣品（G0023）粉末0.5g，分別加入95%乙醇、甲醇、氯仿各25mL，超聲2h，放冷，過濾，補(bǔ)足損失的溶劑，搖勻，濾液用0.22μm微孔濾膜過濾，即得。

1.2.2.2 浸提和超聲的選擇 精密稱取樣品（G0023）粉末0.5g，加入25mL甲醇，分別浸提14h、超聲1h、超聲2h、超聲3h、超聲4h，放冷，過濾補(bǔ)足損失的溶劑，搖勻，濾液用0.22μm微孔濾膜過濾，即得。

1.2.3 方法學(xué)考察

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)液的配制與曲線繪制 精密稱定靈芝酸T 10.67mg、靈芝酸S 10.59mg、靈芝酸R 10.65mg，置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得靈芝酸T、靈芝酸S、靈芝酸R對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別吸取等量的靈芝酸T、靈芝酸S、靈芝酸R的對(duì)照品儲(chǔ)備液，混合制成標(biāo)準(zhǔn)混合母液。然后分別稀釋成5個(gè)濃度梯度，用孔徑0.22μm濾膜過濾，置于進(jìn)樣瓶中。按照上述的色譜條件獲得色譜圖后，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出回歸方程。

1.2.3.2 精密度實(shí)驗(yàn) 取混合對(duì)照品連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定靈芝酸T、靈芝酸S、靈芝酸R峰面積，并計(jì)算峰面積的RSD值。

1.2.3.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取靈芝樣品（G0023）6份，按確定的方法制備供試溶液，測(cè)定靈芝酸T、靈芝酸S、靈芝酸R的含量，并計(jì)算含量的RSD值。

1.2.3.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密稱取靈芝樣品（G0023）1份，按確定方法制備供試溶液，分別在制備后0、5、10、15、20、25h進(jìn)樣測(cè)定靈芝酸T、靈芝酸S、靈芝酸R的峰面積，并計(jì)算峰面積的RSD值。

1.2.3.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含量的靈芝樣品（G0023）9份，精密稱取各約0.1g，按高、中、低3個(gè)濃度，各精密加入一定量的靈芝酸T、靈芝酸S、靈芝酸R對(duì)照品3份，按照確定方法制備供試溶液，測(cè)定靈芝酸T、靈芝酸S、靈芝酸R的含量，并計(jì)算含量的RSD值。1.2.3.6 樣品分析 在相同的液相色譜條件下，分別將對(duì)照品溶液和供試菌絲體的樣品溶液注入高效液相色譜儀中，用外標(biāo)法計(jì)算含量，根據(jù)樣品對(duì)應(yīng)的峰面積和標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各樣品中靈芝酸T、靈芝酸R、靈芝酸S的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理方法的確定

2.1.1 提取溶劑的比較 圖1的結(jié)果表明，三種提取方法的三萜圖譜含有的三萜種類相同，但相同成分的峰高有差異。

表1 不同提取劑提取率的比較Table 1 Comparison of ganderic acids’extraction ratio by different extractants

表1表明，通過SAS 8.2軟件組間差異分析發(fā)現(xiàn)結(jié)合靈芝酸T、靈芝酸S和靈芝酸R三個(gè)指標(biāo)來看，氯仿、甲醇、95%乙醇三種提取劑間，Wilks’Landa統(tǒng)計(jì)量F=8.39，p=0.0042＜0.01，表明三者存在極顯著差異；氯仿和甲醇組間，F(xiàn)=24.36，p=0.005＜0.01，說明兩者存在顯著差異；氯仿和95%乙醇組間，F(xiàn)=12.73，p=0.016＜0.05，說明兩者存在顯著差異；甲醇和95%乙醇組間，F(xiàn)=4.34，p=0.095＞0.05，說明兩者不存在差異。其中氯仿的提取效率最差，目標(biāo)物質(zhì)提取量均最低，甲醇和95%乙醇譜圖相似度高，甲醇的提取效果更好，目標(biāo)物質(zhì)均達(dá)到最高提取量，因此本研究確定采用甲醇作為提取溶劑。

2.1.2 超聲和浸提提取方式的比較 結(jié)合靈芝酸T、靈芝酸S、靈芝酸R三個(gè)指標(biāo)來看，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)浸提和超聲各組組間的Wilks’Landa統(tǒng)計(jì)量F=4.34，p=0.0015＜0.01，表明各組間存在極顯著差異。浸提14h組與超聲1、2、3、4h組均存在顯著性差異，但超聲1、2、3、4h組之間不存在差異很明顯（p＞0.05）。隨著超聲時(shí)間的增加，靈芝酸的提取量升高。因超聲的方法耗時(shí)短、提取的得率高，因此確定超聲2h為最佳提取方式。

2.2 色譜條件的確定

全波長掃描發(fā)現(xiàn)靈芝酸T、靈芝酸S、靈芝酸R在245nm有最大吸收峰，當(dāng)檢測(cè)波長設(shè)為245nm，流動(dòng)相為0.5%冰醋酸溶液和甲醇，柱溫為30℃，流速為1mL/min時(shí)，靈芝酸T、靈芝酸S、靈芝酸R的保留時(shí)間分別為13.5、15.3、19.9min，達(dá)到基線分離（見圖2）。用該色譜條件分析G0023上層菌絲體樣品中這三種靈芝酸，發(fā)現(xiàn)它們和其他的色譜峰能很好的分開，說明該條件可用于靈芝菌絲體中這三種靈芝酸的檢測(cè)（見圖3）。

表2 不同提取方式提取率的比較Table 2 Comparison of GAs’extraction ratio in different extraction ways

圖2 混合對(duì)照品的HPLC圖Fig.2 HPLC chromatograms of mixed reference substances

圖3 G0023上層菌絲體樣品的HPLC圖Fig.3 HPLC chromatograms of Ganoderma sample G0023

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 靈芝酸T、靈芝酸S和靈芝酸R的不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度和峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4。靈芝酸T的線性回歸方程為Y=11106X-68267，r=0.9999；靈芝酸S的線性回歸方程為Y=15521X-51762，r=0.9999；靈芝酸R的線性回歸方程為Y=16736X-37108，r=1.0000。結(jié)果表明，靈芝酸T、靈芝酸S、靈芝酸R的測(cè)試濃度分別在4.571 ～584.256、5 ～320、4.921 ～629.888μg/mL內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

圖4 靈芝酸T（A）、靈芝酸S（B）、靈芝酸R（C）的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of GA-T(（A）、GA-S（B）and GA-R（C）

2.3.2 精密度實(shí)驗(yàn) 取混合對(duì)照品連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算6次測(cè)定的峰面積的RSD，結(jié)果靈芝酸T、靈芝酸S、靈芝酸R峰面積的RSD值（n=6）分別為0.93%、1.76%、1.27%（見表3），表明方法的精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取靈芝樣品（G0023）6份進(jìn)行重復(fù)性測(cè)試，結(jié)果靈芝酸T、靈芝酸S、靈芝酸R含量的RSD值（n=6）分別為1.31%，1.76%、1.29%（見表4），表明方法的重復(fù)性良好。

表3 精密度實(shí)驗(yàn)Table 3 Precision of the measured results

2.3.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 把靈芝樣品（G0023）的供試品溶液，分別在制備后0、5、10、15、20、25h進(jìn)樣測(cè)定，發(fā)現(xiàn)靈芝酸T、靈芝酸S、靈芝酸R的RSD值（n=6）分別為0.71%、0.66%、1.14%（見表5），結(jié)果表明方法的穩(wěn)定性良好。

2.3.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明靈芝酸T、靈芝酸S、靈芝酸R特異性良好。平均加樣回收率和RSD值（n=9）分別為99.1%、2.4%，100.6%、1.1%，100.7%、0.9%。

2.3.6 靈芝菌絲體中靈芝酸的含量的測(cè)定 利用建立的HPLC方法對(duì)不同菌絲體中靈芝酸T、靈芝酸S、靈芝酸R的含量進(jìn)行測(cè)定（見表7）。利用SAS 8.2軟件組間差異分析，結(jié)合119上層菌絲、G0023上層菌絲、赤芝0125-1上層菌絲和下層菌絲四個(gè)指標(biāo)來看，靈芝酸T、靈芝酸S、靈芝酸R三組間，Wilks’Landa統(tǒng)計(jì)量F=28.45，p=0.0003＜0.01。說明不同菌株間的靈芝酸T、靈芝酸S和靈芝酸R的含量差異大，且三者之間的比例也不同，119上層菌絲體靈芝酸T、靈芝酸S和靈芝酸R之間的比為15∶5∶1，而G0023上層菌絲體為2∶2∶1；說明同一菌株不同發(fā)酵部位的菌絲體中靈芝酸T、靈芝酸S和靈芝酸R的含量差異也很大，且比例也不同，如赤芝0125-1上層菌絲體為6∶2∶1，赤芝0125-1下層菌絲體為2∶1∶1。

表4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)Table 4 Reproducibility of the measured results

表5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)Table 5 Stability of the measured results

表6 加樣回收率Table 6 Recoveries for the measured results

表7 不同靈芝菌絲體中靈芝酸的測(cè)定結(jié)果Table 7 Determination of ganoderic acids in different Ganoderma mycelium samples

3 結(jié)論

本研究確定了靈芝菌絲體三萜的提取方法和優(yōu)化利用C18柱同時(shí)檢測(cè)靈芝酸T、靈芝酸S和靈芝酸R的色譜條件，通過精密度、重復(fù)性和加樣回收率的考察，表明本研究獲得的HPLC方法符合作為檢測(cè)方法的要求，適合靈芝發(fā)酵菌絲體中靈芝酸T、靈芝酸S、靈芝酸R的同時(shí)定量分析，是一種理想的靈芝菌絲體中三萜的定量分析方法。

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