楊 娟，張華峰，*，牛麗麗，郭 強

（1.教育部藥用資源與天然藥物化學重點實驗室，西北瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實驗室，

陜西師范大學食品工程與營養(yǎng)科學學院，陜西西安710119；2.西南大學食品科學學院，重慶 400715）

淫羊藿是小檗科淫羊藿屬多年生草本植物，經(jīng)國家衛(wèi)生部（現(xiàn)國家衛(wèi)生和計劃生育委員會）批準可用于保健食品，在食品和醫(yī)藥工業(yè)中具有廣泛用途[1-2]。淫羊藿的主要有效成分為黃酮類化合物，大量研究表明淫羊藿總黃酮具有抗氧化、耐缺氧、促進骨骼發(fā)育、抗衰老等功效[2]，朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C與淫羊藿苷4種黃酮醇糖苷具有抗氧化、防治骨質疏松癥等功效[3-4]?！吨袊幍洌?010版）》（以下簡稱藥典）將總黃酮、淫羊藿苷和朝藿定C列為淫羊藿質量評價指標，近年來的研究顯示朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷皆為淫羊藿的標志化合物（marker compound）[3-5]。目前世界上已知的淫羊藿種約有57個，其中日本約有5種，地中海和西亞地區(qū)約有4種，克什米爾和俄羅斯遠東地區(qū)各有1種，其余的種屬大都分布在我國，因而我國被認為是世界淫羊藿的地理分布中心和物種多樣性中心[6-7]。藥典規(guī)定朝鮮淫羊藿（Epimedium koreanum）、箭葉淫羊藿（E.sagittatum）、心葉淫羊藿（E.brevicornu）、柔毛淫羊藿（E.pubescens）、巫山淫羊藿（E.wushanense）為正品藥材，但是市場上實際流通的淫羊藿在10種以上，這使得市售淫羊藿的質量狀況變得十分復雜[8]。除了我國以外，日本、韓國、東南亞和地中海等國家與地區(qū)也將淫羊藿列為藥用植物。作為世界淫羊藿及其提取物的主要出產(chǎn)國，我國所產(chǎn)淫羊藿的質量直接影響著國際市場上藥材的品質。因此，系統(tǒng)調查我國市售淫羊藿的品質，測定其中朝藿定、淫羊藿苷和總黃酮的含量，分析其抗氧化活性，對于了解我國商品淫羊藿的質量現(xiàn)狀、改善淫羊藿功能性食品的品質具有重要意義。史萬忠等[8]測定了市售淫羊藿中淫羊藿苷的含量，王治平等[9]測定了廣州地區(qū)市售淫羊藿中淫羊藿苷和總黃酮的含量，張俊生等[10]分析了市售箭葉淫羊藿總黃酮提取液對油脂氧化的抑制作用。本研究測定了33批市售淫羊藿樣品中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷和總黃酮的含量，分析了淫羊藿乙醇提取物的抗氧化活性，以期為淫羊藿的品質鑒定和開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Trolox（6-羥基-2，5，7，8-四甲基苯丙二氫吡喃-2-羧酸）純度為98%，美國Sigma公司；DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）、ABTS（2，2’-連氨-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二氨鹽）美國Sigma公司；淫羊藿苷、朝藿定、抗壞血酸（VC）對照品 純度≥98%，美國ChromaDex公司；乙腈 HPLC級，美國Fisher公司；甲醇、無水乙醇、冰乙酸和過硫酸鉀等 國產(chǎn)分析純；33批淫羊藿樣品 購自我國30多個省、自治區(qū)和直轄市，具體信息見表1。

高效液相色譜儀 美國Waters公司；超聲波提取器 武漢嘉鵬電子有限公司；電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；電熱恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司；旋渦混合儀 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；恒溫培養(yǎng)箱 上海精密儀器儀表公司；磁力攪拌器 惠智儀誠（北京）科技發(fā)展有限公司；離心機 上海安亭科學儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 淫羊藿的預處理 淫羊藿樣品分析之前首先進行分類和清理，去掉土塊、羽毛、紙片等雜物，選取葉片并用自來水、蒸餾水依次淋洗，在55℃烘干后粉碎、過篩（80目），再在55℃烘干至恒重，裝入帶蓋離心管中避光保存。

1.2.2 黃酮類化合物的提取 稱取0.2g淫羊藿粉末于具塞三角瓶中，加入50%（v/v）乙醇溶液6mL，混勻后在頻率30kHz、功率300W、溫度50℃下超聲波輔助提取30min，共提取3次，提取液合并后用0.45μm有機系濾膜過濾，得到黃酮類化合物樣品溶液。若樣品溶液不立即進行色譜分析，則置于4℃冰箱避光、密封保存。

1.2.3 朝藿定、淫羊藿苷和總黃酮的定量分析 采用本實驗室建立的反相高效液相色譜法[11]同時測定淫羊藿樣品溶液中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C與淫羊藿苷的濃度并計算淫羊藿藥材中4種標志化合物的含量；采用藥典所述紫外分光光度法測定總黃酮含量。每個實驗設3個重復求平均值。

1.2.4 乙醇提取液的制備 準確稱取淫羊藿粉末0.2g，傾入50mL帶蓋離心管，加入50%乙醇溶液10mL，擰緊管蓋后用旋渦混合儀使溶劑和樣品充分混合，靜置1h后在90℃水浴鍋中溫浴提取30min（水浴前后稱重，若溶劑有損失則需補足減失的重量），最后用有機系濾膜過濾，所得黃綠色濾液即為乙醇提取液（使用前置4℃冰箱避光保存）。

1.2.5 DPPH自由基清除實驗 參考Rao等[12]的方法測定淫羊藿醇提物的DPPH自由基清除率。取0.2mmol/L的DPPH乙醇溶液2mL，加入裝有4mL不同濃度淫羊藿醇提物的具塞試管中，試管封口后在旋渦混合儀上充分混合，然后在37℃水浴中保溫30min，取出后在波長517nm處測定吸光度As；用4mL無水乙醇代替4mL醇提物測得吸光度Ab；用抗壞血酸作陽性對照。每個實驗重復2次。淫羊藿醇提物的抗氧化活性用DPPH自由基清除率來表示，計算公式為：DPPH自由基清除率（%）=（1-As/Ab）×100。參考李晶晶等[13]的方法計算EC50值。

1.2.6 ABTS+自由基清除實驗 參考Kriengsak等[14]的方法測定淫羊藿醇提物的ABTS+自由基清除率。將0.0626g Trolox溶于25mL無水乙醇中配制成濃度為10mmol/L的母液，再用無水乙醇稀釋成濃度依次為50、100、150、200、250、300、350、400μmol/L的梯度溶液。分別取250μL不同濃度梯度溶液，各加入4750μL的ABTS+自由基溶液，在30℃水浴中避光反應6min后在734nm波長處測定吸光度As；對照組用250mL 50%乙醇溶液代替250mL Trolox溶液測得吸光度Ab；實驗組用250μL淫羊藿醇提物代替250mL Trolox溶液測定吸光度As。每個實驗重復2次。以Trolox溶液的濃度為X軸、Trolox對ABTS+自由基的清除率為Y軸繪制標準曲線（Y=0.2514X+2.2052，相關系數(shù)R2=0.9942），以Trolox為參照物計算淫羊藿醇提物的抗氧化活性和EC50值。ABTS+自由基清除率的計算公式為：ABTS+自由基清除率（%）=（1-As/Ab）×100。

2 結果與分析

2.1 淫羊藿黃酮類化合物的含量

由表1可知，不同地區(qū)商品淫羊藿中黃酮類化合物的含量差異很大，變異系數(shù)在29.76% ～87.79%之間。其中，四川成都的朝藿定A含量最高（3.01mg/g），黑龍江哈爾濱最低（0.37mg/g）；上海的朝藿定B含量最高（5.22mg/g），黑龍江哈爾濱最低（0.25mg/g）；福建三明的朝藿定C含量最高（19.27mg/g），寧夏吳忠最低（0.46mg/g）；上海的淫羊藿苷含量最高（13.40mg/g），黑龍江哈爾濱最低（0.41mg/g）；上海的總黃酮含量最高（68.73mg/g），寧夏吳忠最低（18.29mg/g）。藥典規(guī)定總黃酮含量不得低于50mg/g，淫羊藿苷不低于5mg/g，朝藿定C不低于10mg/g。然而，33批市售淫羊藿樣品中僅上海、福建三明等8個地區(qū)的總黃酮含量達到藥典要求，達標率為24.2%；上海、天津等14個地區(qū)的淫羊藿苷含量達到藥典要求，達標率為42.4%；福建三明、重慶等6個地區(qū)的朝藿定C含量達到藥典要求，達標率為18.2%。按照藥典對總黃酮、淫羊藿苷和朝藿定C的要求，藥材合格率為30.3%?？梢钥闯?，大多數(shù)市售淫羊藿樣品的質量較差。史萬忠等[8]和王治平等[9]也發(fā)現(xiàn)市售淫羊藿中淫羊藿苷與總黃酮的含量大都沒有達到藥典要求。筆者在文獻調研[8-9，15]和實驗研究的基礎上統(tǒng)計了2001 ～2013年市售淫羊藿藥材合格率的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)近十年來國內(nèi)市場淫羊藿藥材的質量呈緩慢下降趨勢（圖1）。造成這種現(xiàn)象的原因可能是淫羊藿藥材的種植、采摘、收購環(huán)節(jié)中缺少必要的檢測和有效的監(jiān)管。大量研究顯示，淫羊藿體內(nèi)黃酮類化合物的積累過程既受到遺傳因素的影響[4]，又受到環(huán)境因素（包括采摘時期、土壤、光照、氣溫、降水量等）的影響[15-18]。如果在種植和采摘環(huán)節(jié)中忽視品種和收獲季節(jié)的選擇，或者在收購環(huán)節(jié)中忽視品種的鑒定（含偽品的甄別）和標志化合物的檢測，都可能使藥材質量大打折扣。

表1 不同地區(qū)商品淫羊藿中黃酮類化合物的含量Table 1 Contents of flavonoids in Epimedii Folium in different areas of China

圖1 不同年份市售淫羊藿質量狀況Fig.1 Current status of quality of Epimedii Folium in different years

從表1還可看出，淫羊藿中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷4種標志化合物的含量不存在消長關系即各自含量沒有相關性，例如甘肅蘭州市售淫羊藿中淫羊藿苷含量雖然較低（3.26mg/g），但是朝藿定C含量卻很高（11.55mg/g），而黑龍江哈爾濱的淫羊藿苷和朝藿定B含量均較低（0.41mg/g和0.25mg/g）。朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷的功效不盡相同[4]，單純以淫羊藿苷或朝藿定C作為評價指標不能全面反映淫羊藿的內(nèi)在品質[2]。遺憾的是，雖然將朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷4種黃酮醇糖苷作為淫羊藿的標志化合物已經(jīng)成為很多學者的共識[3-5，19]，但是藥典至今尚沒有關于朝藿定A和朝藿定B的含量標準，在一定程度上影響了淫羊藿的質量控制。

2.2 淫羊藿的抗氧化活性

由表2可知，不同地區(qū)商品淫羊藿醇提物的抗氧化活性差異很大。在ABTS實驗中，以Trolox溶液濃度為X軸、Trolox對ABTS+的清除率為Y軸繪制標準曲線（Y=0.2514X+2.2052，相關系數(shù)R2=0.9942），計算出淫羊藿醇提物的EC50值在4.71 ～21.96μg/mL之間，其中黑龍江哈爾濱地區(qū)市售淫羊藿的ABTS+·清除能力最強（4.71μg/mL），福建三明最弱（21.96μg/mL）；在DPPH自由基清除實驗中，EC50值的范圍在0.27 ～3.51μg/mL之間，其中湖南邵陽地區(qū)市售淫羊藿的自由基清除能力最強（0.27μg/mL），山西清徐最弱（3.51μg/mL），所有淫羊藿樣品的DPPH自由基清除率均高于VC。相關性分析表明，淫羊藿醇提物的抗氧化活性與朝藿定C、總黃酮含量的相關性較高，而與朝藿定A、朝藿定B、淫羊藿苷含量的相關性較低（表3）。這說明，朝藿定C是淫羊藿中抗氧化活性較強的黃酮類化合物，但并非唯一的抗氧化物質，在淫羊藿中很可能還存在著其他一些抗氧化活性較強的化合物。盡管ABTS實驗與DPPH實驗得出的R2數(shù)據(jù)不同，但是黃酮類化合物與抗氧化活性相關性的整體趨勢相似，這可能是由于DPPH與ABTS實驗的反應機制不同，而反映的抗氧化活性本質基本一致。

表2 不同地區(qū)商品淫羊藿醇提物的抗氧化活性Table 2 Antioxidant activities of alcoholic extracts of Epimedii Folium in different areas of China

表3 淫羊藿黃酮類化合物與抗氧化活性的相關性Table 3 Relationship between antioxidant capacities and flavonoids in Epimedii Folium

3 結論

本研究系統(tǒng)測定了不同地區(qū)商品淫羊藿中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷與總黃酮的含量及其DPPH·、ABTS+·清除能力。結果表明，不同地區(qū)淫羊藿中黃酮類化合物的含量變異較大，抗氧化活性也存在較大差異，藥材質量參差不齊。淫羊藿的抗氧化活性與朝藿定C、總黃酮含量的相關性較高，而與朝藿定A、朝藿定B、淫羊藿苷含量的相關性較低。淫羊藿黃酮類化合物的含量變異與抗氧化活性分析為其品質鑒定和質量控制提供了依據(jù)，同時也為淫羊藿功能性食品的生產(chǎn)提供了參考。

[1]Zhang HF，Yang XH.Asian medicine：protect rare plants[J].Nature，2012，482：35.

[2]張華峰，楊曉華.淫羊藿在食品工業(yè)中的應用現(xiàn)狀與展望[J].食品工業(yè)科技，2010，31（5）：390-393.

[3]Zhang DW，Cheng Y，Wang NL，et al.Effects of total flavonoids and flavonol glycosides from Epimedium koreanum Nakai on the proliferation and differentiation of primary osteoblasts[J].Phytomedicine，2008，15（1-2）：55-61.

[4]Zhang HF，Yang TS，Li ZZ，et al.Simultaneous extraction of epimedin A，B，C and icariin from Herba Epimedii by ultrasonic technique[J].Ultrasonics Sonochemistry，2008，15（4）：376-385.

[5]Wang YK，Huang ZQ.Protective effects of icariin on human umbilical vein endothelial cell injury induced by H2O2in vitro[J].Pharmacological Research，2005，52（2）：174-182.

[6]李作洲，徐艷琴，王瑛，等.淫羊藿屬藥用植物的研究現(xiàn)狀與展望[J].中草藥，2005，36（2）：289-295.

[7]Zhang YJ，Dang HS，Wang Y，et al.A taxonomic revision of unifoliolate Chinese Epimedium L.（Berberidaceae）[J].Kew Bulletin，2011，66（2）：253-262.

[8]史萬忠，徐德生，劉力，等.30批市售淫羊藿的質量分析[J].中國實驗方劑學雜志，2006，12（7）：6-7.

[9]王治平，樊化，楊珂，等.廣州地區(qū)幾種市售淫羊藿藥材的質量分析[J].時珍國醫(yī)國藥，2005，16（11）：1075-1076.

[10]張俊生，陳莉華，湯小虎，等.淫羊藿總黃酮的超聲輔助提取及其抗氧化活性[J].生物加工過程，2012，10（1）：13-18.

[11]張華峰，高翔，盧大炎，等.HPLC法同時測定淫羊藿中朝藿定A、B、C與淫羊藿苷的含量[J].分析測試學報，2007，26（2）：198-201.

[12]Rao KS，Chaudhury PK，Pradhan A.Evaluation of antioxidant activities and total phenolic content of Chromolaena odorata[J].Food and Chemical Toxicology，2010，48（2）：729-732.

[13]李晶晶，楊璞，葉立方.一種簡單、精確計算EC50的方法[J].數(shù)理醫(yī)學雜志，2001，14（6）：8-9.

[14]Kriengsak T，Unaroj B，Kevin C，et al.Comparison of ABTS，DPPH，F(xiàn)RAP，and ORAC assays for estimating antioxidant activity from guava fruit extracts[J].Journal of Food Composition and Analysis，2006，19（6-7）：669-675.

[15]王蕾蕾，黃海欣，孫振國.28批淫羊藿飲片質量考察[J].基層中藥雜志，2001，15（3）：26-26.

[16]Shen P，Guo B，Gong Y，et al.Taxonomic，genetic，chemical and estrogenic characteristics of Epimedium species[J].Phytochemistry，2007，68（10）：1448-1458.

[17]魏國燕，陳建軍，廖思紅，等.光照對淫羊藿活性成分生物合成的影響[J].植物科學學報，2012，30（4）：415-422.

[18]陳翠萍，沙明，楊松松.朝鮮淫羊藿中黃酮類成分在不同采收期的含量變化[J].中國中藥雜志，1996，21（2）：86-88.

[19]Liu JJ，Li SP，Wang YT.Optimization for quantitative determination of four flavonoids in Epimedium by capillary zone electrophoresis coupled with diode array detection using central composite design[J].Journal of Chromatography A，2006，1103（2）：344-349.