國玉芝，曲秀梅，太史婧華，方 芳，張志國

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154003)

細(xì)胞色素P4501B1 (cytochrome P450 1B1,CYP1B1)是細(xì)胞色素P450超基因家族成員之一，被認(rèn)為其基因在癌癥特異性高表達(dá)[1]及由于其影響雌激素受體(estrogen receptor，ER)和孕激素受體(progesterone receptor，PR)表達(dá)而成為多種女性癌癥(乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌)的致病基因[2～4]，但是不同研究者得出的結(jié)論不盡相同。本文力圖通過檢測乳腺癌手術(shù)患者血液CYP1B1 SNP rs1056827、rs1056836基因多態(tài)性與病理組織ERα、PR表達(dá)的關(guān)系及病理組織與癌旁組織CYP1B1表達(dá)與乳腺癌的關(guān)系，從而為臨床診治提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇本院2010～2013年末乳腺癌手術(shù)患者作為研究對象，手術(shù)前采集患者血樣留作檢測CYP1B1 SNP rs1056827，rs1056836基因多態(tài)性樣本，手術(shù)時(shí)留存病理及癌旁組織石蠟包埋組織塊作為檢測CYP1B1、ERα、PR表達(dá)樣本。

儀器:S1000 Thermal Cycler PCR儀、PowerPac Universal 通用型電泳儀、ChemiDoc XRS 凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；H2500R-2高速冷凍離心機(jī)(上海滬譽(yù)貿(mào)易有限公司)。

試劑:Thermo Scientific GeneJET Genomic DNA Purification Kit、Thermo Scientific Maxima Hot Start Green PCR Master Mix (2X)、GeneRuler 100 bp DNA Ladder、Thermo Scientific FastDigest Eam1105 I、Thermo Scientific FastDigest AleI 內(nèi)切酶，以上試劑為Fermentas公司生產(chǎn)。CYP1B1 SNP rs1056827，rs1056836擴(kuò)增引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，DNA測序由生工生物工程(上海)股份有限公司北京測序部完成。SP試劑盒、ERa鼠抗人單克隆抗體、PR鼠抗人單克隆抗體、兔抗人CYP1B1多克隆抗體，購自上海科彩生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因檢測

CYP1B1 SNP rs1056827 PCR引物：F 5＇...CTCGTT-CGCTCGCCTGGCGC ...3＇R 5＇...GAAGTTGCGCATC-ATGCTGT...3＇;CYP1B1 SNP rs1056836 PCR引物：F 5＇...ATGCGCTTCTCCAGCTTTGT...3＇R 5＇...TATGGAGCACACCTCACCTG...3＇；擴(kuò)增體系：Thermo Scientific Maxima Hot Start Green PCR Master Mix (2X)12.5μL，F(xiàn)、R primer各1μL，血液DNA 1μL，ddH2O 9.5μL；PCR條件：預(yù)變性95℃4min、變性95℃30s、退火56℃30s，延伸72℃30s，72℃末延伸5min；共35個(gè)循環(huán)；酶切體系及條件：10X FastDigest Green Buffer 2μL，F(xiàn)astDigest enzyme 1μL(rs1056827使用Eam1105I，rs1056836使用AleI)，ddH2O 17μL，PCR 產(chǎn)物10μL；水浴37℃酶切10min，然后取出立即置水浴65℃滅活5min。電泳：使用2%瓊脂糖凝膠，電壓145V，電泳45min。觀察結(jié)果及拍照：電泳結(jié)束，把凝膠從膠板上取出，放到凝膠成像系統(tǒng)中按凝膠成像儀中觀察結(jié)果并拍照。

1.2.2 ERa, PR免疫組化檢測

(1)切片：乳腺癌病理標(biāo)本同時(shí)制成約5μm厚切片，(2)脫蠟：切片放入盛有二甲苯的容器中脫蠟3次，每次10min；(3)洗滌切片：經(jīng)下行酒精水化，無水乙醇5min，95%乙醇2 次(每次2min)，85%乙醇2min；75%乙醇2min，自來水沖洗，ddH2O洗2次，每次2min；(4)抗原修復(fù)：浸入枸椽酸鈉緩沖液中微波爐抗原修復(fù)20min，自然冷卻，滴加1：200稀釋的兔抗人CYP1B1抗體(一抗)，完全覆蓋組織，4℃過夜。加山羊血清封閉10min,傾去封閉液，滴加二抗工作液，37℃水浴床孵育30min。滴加高敏過氧化物酶，37℃水浴床孵育30min。滴加新鮮配制的DAB溶液，顯色10min，自來水沖洗，蘇木素輕度復(fù)染1min，鹽酸乙醇分化，淡氨水返藍(lán)，脫水，中性樹膠封固。每次染色均以已知陽性的乳腺癌切片作為CYP1B1陽性對照，用PBS代替一抗作陰性對照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

基因型分布和等位基因頻率經(jīng)χ2檢驗(yàn)計(jì)算器v1.61進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 CYP1B1 擴(kuò)增產(chǎn)物酶切后電泳

A rs1056827，L 100bp DNA Ladder ;2、5 G/G野生型純合子，1、3 G/T雜合子，4、6 T/T突變型純合子； B rs1056836, L 100bpDNA Ladder ;1、3、6、C/C野生型純合子，2、5 C/G雜合子，4 G/G突變型純合子。

2 結(jié)果

2.1 基因型分析

CYP1B1 SNP rs1056827擴(kuò)增產(chǎn)物為250bp。野生型純合子 G/G為250bp一條帶；雜合子G/T為114、136、250bp三條帶；突變型純合子T/T為：114、136bp兩條帶。CYP1B1 SNP rs1056836 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物623bp，野生型純合子C/C為491、132bp兩條帶；雜合子C/G為623、491、132bp三條帶；突變型純合子 G/G為623bp一條帶。CYP1B1 SNP rs1056827，rs1056836擴(kuò)增產(chǎn)物酶切后電泳結(jié)果如圖1。

2.2 CYP1B1、Era、PR免疫組化分析

判斷標(biāo)準(zhǔn):Era、PR、CYP1B1著色部位在細(xì)胞核，胞核有棕黃色顆粒即判斷為Era、PR、 CYP1B1表達(dá)陽性。陽性細(xì)胞數(shù)<5%記為陰性(-)，陽性細(xì)胞數(shù)>5%記為陽性(+)。不同CYP1B1基因型Era、PR表達(dá)情況，見表1。

表1 CYP1B1基因多態(tài)性與ERa, PR表達(dá)

通過χ2檢驗(yàn)，各基因型與ERa, PR陽性表達(dá)之間的差異沒有顯著性，按照常規(guī)比較方法，將CYP1B1 rs1056827、1056836 GT、TT，CG、GG基因型合并后比較，基因型與ERa, PR陽性表達(dá)之間的差異也沒有顯著性，因此CYP1B1 rs 1056827，1056836基因多態(tài)性與ERa, PR陽性表達(dá)之間可能沒有關(guān)系。120例乳腺癌病理組織及癌旁組織CYP1B1表達(dá)分別為106和0例，說明CYP1B1的過表達(dá)與乳腺癌相關(guān)。

3 討論

有研究認(rèn)為腫瘤組織CYP1B1 rs1056836基因多態(tài)性與ERa, PR陽性表達(dá)之間相關(guān)[2]，也有研究認(rèn)為乳腺癌腫瘤組織CYP1B1 rs1056836基因多態(tài)性與ERa, PR陽性表達(dá)之間不相關(guān)[3]，本研究結(jié)果與劉春蓮研究結(jié)果相同，即CYP1B1 SNP rs1056827，rs1056836基因多態(tài)性與ERa, PR陽性表達(dá)之間沒有關(guān)系。有研究者認(rèn)為CYP1B1在多種腫瘤組織中(如乳腺、子宮、腎、結(jié)直腸等)特異性高表達(dá)，而在相應(yīng)的正常組織中不表達(dá)[1]，我們的研究與文獻(xiàn)報(bào)道一致，即CYP1B1在腫瘤組織表達(dá)率非常高，而在非腫瘤組織中不表達(dá)，本研究證實(shí)了這種理論。

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[4]陳悅，鄧覲云，李張?jiān)?，?乳腺癌CYP1B1基因與ER、PR的表達(dá)關(guān)系及臨床意義[J].江西醫(yī)藥，2009，44(12)：1176-1178