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        非小細胞肺癌胸腔積液與小活檢標本中EGFR基因突變檢測的比較

        2014-04-25 05:14:12田俏梅吳白平
        黑龍江醫(yī)藥科學(xué) 2014年3期
        關(guān)鍵詞:基因突變胸腔積液

        趙 瑾,田俏梅,吳白平

        (湖南省腫瘤醫(yī)院/中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院,湖南長沙410013)

        目前,針對初診的非小細胞肺癌晚期患者應(yīng)常規(guī)檢測表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因突變,用于選擇是否一線或二線使用非替尼、厄洛替尼等小分子酪氨酸酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors,TKIs)。目前臨床用于EGFR檢測的標本主要是腫瘤組織學(xué)和細胞學(xué)標本,包括手術(shù)切除標本、活檢組織標本、新鮮穿刺標本以及胸腔積液、痰液等。血液學(xué)標本目前處于臨床研究階段,暫

        未在臨床進行使用。由于胸腔積液中的腫瘤細胞數(shù)量較少,其主要用于無法獲得組織標本的情況下使用,且需要靈敏度較高的檢測方法才能提高EGFR基因突變的檢出率。本研究針對中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院存檔的非小細胞肺癌活檢標本和胸腔積液標本,用焦磷酸測序的方法檢測EGFR基因18~21外顯子突變檢測,探討胸腔積液作為晚期非小細胞肺癌患者EGFR基因檢測標本的臨床意義。

        1 材料與方法

        1.1 研究對象

        收集2013-03~2014-02中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤醫(yī)院初診的非小細胞肺癌患者胸腔鏡活檢標本43例,配對收集相同患者胸腔積液43例。其中男24例,女19例,中位年齡58歲。病理組織類型為腺癌36例、鱗癌7例。

        1.2 樣本的采集和處理

        收集患者胸腔鏡下新鮮活檢標本和50ml胸腔積液,胸腔積液在室溫下13000r/min離心10min,棄上清,將細胞沉淀進行細胞涂片,經(jīng)病理醫(yī)生評估后,確保為非小細胞肺癌標本,且腫瘤細胞含量>5%后,立即常溫下送至檢驗科。采集同一患者配對的新鮮活檢組織,采用中性福爾馬林溶液固定及石蠟包埋,經(jīng)病理醫(yī)生評估選取腫瘤細胞含量>10%以上的石蠟組織,切取5μm厚的石蠟白片10~15片,置于無菌的EP管中,用二甲苯和無水乙醇脫蠟后沉淀、烘干。

        1.3 基因組DNA提取

        采用德國凱杰公司的QIAamp DNA FFPE Tissue試劑盒(貨號:56404),按試劑盒說明書操作提取基因組DNA,用上海元析公司的B-500超微量分光光度計測定DNA純度及含量,要求 A280/A260>1.80。

        1.4 PCR擴增和焦磷酸測序

        采用長沙三濟生物科技有限公司的EGFR基因突變檢測試劑盒,對EGFR基因18~21外顯子進行PCR擴增和PCR產(chǎn)物的焦磷酸測序,所有操作按試劑盒說明書進行,實驗全程設(shè)立陰陽對照。采用德國凱杰公司的PyroMark Q24焦磷酸測序儀進行測序。將得到的基因序列與Genbank中的EGFR基因標準序列(序列號:NG_007726)進行比對,分析測序結(jié)果。

        1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

        采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,卡方檢驗,檢驗水準α=0.05,以P > 0.05為差異無統(tǒng)計學(xué)意義,P < 0.05為差異具體統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 活檢標本EGFR基因突變率

        43例胸腔鏡下非小細胞肺癌活檢標本中檢出EGFR基因突變型12例,野生型31例,EGFR基因突變率為27.9%(12/43)。其中,EGFR基因第19外顯子突變8例,突變率為66.6%(8/12),第21外顯子突變8例,突變率為33.3%(4/12),見圖1。

        圖1 焦磷酸測序檢測EGFR基因突變

        2.2 胸腔積液標本EGFR基因突變率

        胸腔積液標本中檢出EGFR基因突變型11例,野生型32例,EGFR基因突變率為25.6%(11/43)。胸腔積液標本EGFR基因檢測結(jié)果有一例與配對活檢組織不符合,其他結(jié)果均一致,見圖2。胸腔積液中細胞的EGFR基因突變率略低于活檢組織標本,但兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表1。

        表1 非小細胞肺癌胸腔鏡下活檢標本EGFR基因突變率(n=43)

        圖2 同一患者胸腔積液標本與活檢組織標本中EGFR基因檢測不符合的測序

        3 討論

        肺癌的死亡率在世界范圍內(nèi)的癌癥中最高,絕大部分的肺癌為非小細胞肺癌。改癌癥的藥物靶向治療是目前較先進的技術(shù)之一。其EGFR基因是參與調(diào)控腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲、血管生成和轉(zhuǎn)移,是非小細胞肺癌重要的治療靶點之一[1]。而治療的療效往往可通過對EGFR基因的突變檢測進行評價,酪氨酸激酶抑制劑(TKI)為靶向治療的藥物,非小細胞肺癌的EGFR基因突變與TKI有特異性反應(yīng),也是預(yù)測KTI治療療效的指標之一,因此對非小細胞肺癌中EGFR基因突變的檢測就能評估治療的療效[2~4]。那么對于腫瘤基因的提取是整個評價過程的關(guān)鍵,通??梢赃x用腫瘤組織小活檢標本進行,但活檢不僅有創(chuàng)也較為復(fù)雜。而目前較多的研究表明,非小細胞肺癌晚期患者往往會有胸腔積液,且在積液中能發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞[5]。因此胸腔積液也能提取EGFR基因進行突變檢測而代替小活檢組織標本。

        本研究通過配對收集相同患者的腫瘤組織小活檢標本與患者的胸腔積液采用PCR擴增和焦磷酸測序的方法來對比分析兩種標本是否存在檢測結(jié)果的一致性。結(jié)果表明,胸腔鏡下非小細胞肺癌活檢標本檢出EGFR基因突變型12例,EGFR基因突變率為27.9%(12/43)。胸腔積液標本共檢出EGFR基因突變型11例,EGFR基因突變率為25.6%(11/43),差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),這與國內(nèi)外多數(shù)研究的結(jié)果基本一致[6~8]。然而國外有研究卻不支持改觀點[9],本研究通過仔細核對標本的收集、送檢、數(shù)據(jù)分析以及對比的研究的可靠性,結(jié)果還是胸腔積液標本與腫瘤組織小活檢標本結(jié)果無差異,支持胸腔積液標本能代替小活檢標本進行檢測。

        此外,在本研究中發(fā)現(xiàn)胸腔積液標本EGFR基因檢測結(jié)果有一例與配對活檢組織不符合,其他結(jié)果均一致,這可能是胸腔積液腫瘤基因突變存在異質(zhì)性有關(guān),具體可能為靶向治療后基因的檢測的變換,更大的可能性為腫瘤的轉(zhuǎn)移與原發(fā)病灶不一樣。那么對于這種現(xiàn)象,可以在胸腔積液標本檢測的基礎(chǔ)上取腫瘤組織標本進行檢測,理論上活檢組織的檢測結(jié)果更支持臨床需要。

        通過實驗以及參照文獻,基本可以認為非小細胞肺癌患者的胸腔積液標本能夠代替腫瘤組織活檢標本對EGFR基因突變的檢測?;诖擞^點,由于胸腔積液的收集更為簡便,檢測也較可靠,在臨床上可以參考應(yīng)用。

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        [5]謝強,陳群,石琴,等.內(nèi)科胸腔鏡非小細胞肺癌活檢標本及胸腔積液中EGFR基因突變檢測[J].臨床與實驗病理學(xué)雜志,2013,29(8):881-883

        [6]王立帥,張瑜,陸小軍,等.雙環(huán)探針特異引物熒光聚合酶鏈反應(yīng)法檢測非小細胞肺癌表皮生長因子受體基因突變[J].中華病理學(xué)雜志,2011,40(10):667 -670

        [7]范苗靜,李海剛,呂志強,等.表皮生長因子受體基因突變與非小細胞肺癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系[J].中華病理學(xué)雜志,2011,40(10):679 -682

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