張丹丹，萬金慶 ，姚志勇，龐文燕，王國強(qiáng)，厲建國

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306)

羅非魚(Tilapias)原產(chǎn)于非洲，俗稱非洲鯽魚，屬鱸形目(Perciformes)麗鯛科(Cichlidae)羅非魚屬(Tilapia)，因其具有適應(yīng)性強(qiáng)、繁殖率高、生長速度快、抗病能力強(qiáng)、肉多刺少、易于加工等優(yōu)點(diǎn)，已成為中國養(yǎng)殖水產(chǎn)品中最突出的貿(mào)易產(chǎn)品［1-2］。由于其對水溫要求相對較高，生存溫度范圍為15～35℃，在我國廣東等溫度較高地區(qū)養(yǎng)殖規(guī)模較大［3］。冰溫技術(shù)在水產(chǎn)品保鮮的研究在國內(nèi)報道越來越多，通過對青魚［4］、牙鲆［5］、草魚［6］等的研究，冰溫貯藏條件更能有效地抑制水產(chǎn)品體內(nèi)微生物的繁殖，延長食品的貯藏期。冰溫貯藏運(yùn)輸不但能保持魚、肉類食品原有風(fēng)味，而且可以提高其口感與新鮮度。日本學(xué)者在冰溫技術(shù)中特別強(qiáng)調(diào)兩個方面，“生物體的防御反應(yīng)”和恒溫技術(shù)。為了將生物體防御反應(yīng)所產(chǎn)生的氨基酸等營養(yǎng)成分的轉(zhuǎn)化達(dá)到最大化，必須進(jìn)行冷卻誘導(dǎo)［7］。但不同的生物體冷卻誘導(dǎo)的溫度與速度也是不同的，這方面的研究報道極少。本實驗中采用不同的初始誘導(dǎo)溫度對羅非魚進(jìn)行了研究，得到最佳的冷誘導(dǎo)初始溫度，同時對羅非魚的鮮度和滋味游離氨基酸進(jìn)行檢測分析，研究在鮮度極好的條件下，滋味游離氨基酸的變化，旨在為羅非魚冷誘導(dǎo)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

羅非魚 2012 年8 月份羅非魚，采購于上海市臨港新城古棕路菜市場，體重500～600g/尾，購買后充氧迅速運(yùn)回實驗室。將活魚置于保活箱中蓄養(yǎng)1～2h，避免其掙扎，然后將活魚敲擊致死后，片成魚片，分裝入保鮮袋置于冷環(huán)境中;三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、肌苷酸(IMP)、次黃嘌呤(Hx) Sigma 公司;一磷酸腺苷(AMP) 日本TCI公司;肌苷(HxR) 德國Dr.Ehrenstorfer 公司;磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀 上海安譜科學(xué)儀器公司，色譜純;超純水、高氯酸(PCA)、氫氧化鉀、氫氧化鈉、磷酸、磺基水楊酸 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純;甲醇 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，色譜純。

LC-2010CHT 高效液相色譜儀、AUW320 電子天平 日本島津公司;L-8800 氨基酸全自動分析儀 HITACHI 公司;Agilent-34972A 溫度采集儀 安捷倫公司;BPS-250CB(-20～100℃)恒溫恒濕箱、DHG-9053A 電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;IMS-50 全自動雪花制冰機(jī) 常熟雪科有限公司;SB25-12DT 超聲機(jī) 寧波新芝生物科技;FA25均質(zhì)機(jī) Fluko 公司;PHS-3C 型pH 計 上海精密科學(xué)儀器有限公司;H2050R 冷凍離心機(jī) 長沙湘儀有限公司;GM-0.33A 隔膜真空泵及溶劑過濾器 天津市津騰實驗設(shè)備有限公司;Haier BCD-216SCM 冰箱 青島海爾公司。實驗用的器材均采用超聲機(jī)清洗20min，用蒸餾水反復(fù)沖洗，然后用超純水潤洗2～3遍，烘干機(jī)烘干備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 冰點(diǎn)的測定 沿脊椎把魚剖為兩片，將熱電偶插入魚體表下約0.5cm 處并固定，放入-20℃的凍藏室，溫度采集間隔為10s 采集一次數(shù)據(jù)，實驗結(jié)束后繪制凍結(jié)曲線并得出羅非魚冰點(diǎn)。

1.2.2 不同冷誘導(dǎo)初始溫度的冷誘導(dǎo)方式降溫程序的設(shè)定 5 種不同的初始溫度，分別為25、20、15、10、5℃，均采用溫控降溫。降溫程序見表1。

表1 降溫程序的設(shè)置Table 1 Cooling program sitting

以同樣的降溫速率降溫，讓魚肉緩慢的適應(yīng)冷環(huán)境，直至降至冰溫帶，并維持冰溫條件一段時間。

1.2.3ATP 及其關(guān)聯(lián)化合物的檢測 參考Yokoyama［8］的方法，略有改動。魚片ATP 及關(guān)聯(lián)化合物的提取:取新鮮魚片和經(jīng)過冷處理后的樣品，快速切碎后取5g 放入離心管中，加入預(yù)冷的10mL 10%的高氯酸(PCA)溶液打漿2min。勻漿后用10000r/min 冷凍離心15min，取上清液。沉淀用預(yù)冷的5% PCA 洗滌，離心取上清液，重復(fù)操作一次。合并上清液，先用10mol/L 的KOH 溶液調(diào)節(jié)pH，待接近所需pH 時，改用1mol/L 的KOH 溶液精調(diào)pH 為6.5，靜置30min 后將上清液轉(zhuǎn)移至50mL 容量瓶中，并用超純水定容，搖勻，用0.45μm 微孔過濾膜過濾后等待測定。整個過程均在0～4℃條件下操作。

高效液相色譜(HPLC)檢測色譜條件:GL Sciences 公司Inertsil ODS-SP C18(4.6mm ×250mm，5μm)液相色譜柱;保護(hù)柱柱芯Inertsil ODS-SP(4mm×10mm，5μm);流動相:A 為0.05mol/L 磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀(1∶1)溶液，用磷酸調(diào)至pH6.5，B 為甲醇溶液;等度洗脫;流速:1mL/min;柱溫:28℃;進(jìn)樣量:10μL;檢驗波長:254nm。

鮮度指標(biāo)K 值是反映水產(chǎn)品初期鮮度變化以及風(fēng)味有關(guān)的生化指標(biāo)。Saito［9］等人提出以ATP 及其相關(guān)化合物作為評定魚類鮮度指標(biāo)以來，許多學(xué)者通過沙丁魚［10］、海鰻［11］、大黃魚［12］等水產(chǎn)品研究K值與鮮度之間的關(guān)系，K 值是一種公認(rèn)的評價魚早期鮮度的指標(biāo)，即殺魚的K 值在10%以下。K 值越小表示鮮度越好，K 值越大則鮮度越差。作為生食魚片的K 值在一級鮮度20%以下，20%～40%為二級鮮度，60%～80%為初期腐敗魚。魚肌肉中ATP 按ATP→ADP→AMP→IMP→HxR→Hx 途徑降解，其中HxR+Hx 與ATP 及其降解產(chǎn)物總和的比值，即為K值，可用下式表示:

1.2.4 游離氨基酸的檢測 參考鄧捷春［13］的游離氨基酸測定方法，略有改動。游離氨基酸的提取:分別稱取魚肉2g，加入10mL 5%(w/v)磺基水楊酸，沉淀2h使蛋白質(zhì)沉淀下來，吸取6mL 上清液用10000r/min冷凍離心機(jī)離心15min，取3mL 上清液，用一定量NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 至2.0 左右，定容至12mL，用0.45μm 微孔過濾后裝至樣品盤中上機(jī)測定。

分析條件:L-8800 型氨基酸自動分析儀，樣品分析周期53min。色譜柱(4.6mm ×150mm，7μm);柱溫:50℃;通道1 流速:0.4mL/min，通道2 流速:0.35mL/min。流動相:pH 分別為3.3、3.2、4.0、4.9 的檸檬酸和檸檬酸鈉混合緩沖液和濃度為4%茚三酮的緩沖液。

2 結(jié)果與討論

2.1 冰點(diǎn)的測定

羅非魚的凍結(jié)曲線如圖1 所示。數(shù)據(jù)顯示羅非魚的凍結(jié)點(diǎn)在-1.2℃左右，因此可以認(rèn)為當(dāng)羅非魚片的貯藏溫度降至冰點(diǎn)后再持續(xù)下降時，魚片細(xì)胞內(nèi)開始結(jié)晶，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。根據(jù)測得的羅非魚片的冰點(diǎn)，本文實驗是將羅非魚片降至冰溫帶后，魚片溫度定位在(-0.5 ±0.3)℃范圍內(nèi)保持不變。

圖1 羅非魚凍結(jié)曲線Fig.1 Freezing curve of Tilapia

2.2 魚片溫度的變化

羅非魚魚片前35h 降溫曲線如圖2 所示。結(jié)果表明:方式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ降溫曲線均呈連續(xù)降溫趨勢，并分別在27、22、17、12、7h 左右到達(dá)冰溫帶，并維持在冰溫帶一段時間，保持羅非魚魚片溫度在(-0.5 ±0.3)℃。

圖2 羅非魚魚片的溫度變化Fig.2 Temperature change of Tilapia fillets

2.3 鮮度指標(biāo)K 值的變化

通過計算，在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ5 種初始溫度不同的冷誘導(dǎo)方式下，羅非魚K 值的變化如圖3 所示。

圖3 不同的初始溫度冷誘導(dǎo)條件下羅非魚片K 值變化Fig.3 K value of Tilapia fillets with different initial temperature cold-induction modes

由圖3 可以看出，5 種不同初始溫度的冷誘導(dǎo)方式，對羅非魚魚片K 值的影響，K 值在降溫過程中，隨貯藏時間變長，均呈上升趨勢，新鮮魚片的K 值為2.27%。方式Ⅰ和ⅡK 值上升較快，方式Ⅲ次之，方式Ⅳ和Ⅴ增長緩慢，呈平緩上升趨勢。方式Ⅰ誘導(dǎo)27h 后，K 值剛到20%，還在一級鮮度范圍內(nèi);在28～70h 后K 值超過40%，魚片處于二級鮮度階段;在171h K 值為46.1%，還未到腐敗階段。方式Ⅱ在30h處，超過一級鮮度指標(biāo)20%，在70～142h 處K 值均超過30%，且在142h 接近二級鮮度指標(biāo)。方式Ⅲ在50h 仍處于一級鮮度指標(biāo)范圍內(nèi)，直到161h，K 值36.7%，在二級鮮度指標(biāo)范圍內(nèi)。方式Ⅳ和方式Ⅴ，分別在108 和127h 到達(dá)一級鮮度指標(biāo)，到150h 未超過30%，維持在較高的鮮度水平。

2.4 核苷酸IMP 及ATP 分析

肌苷酸(IMP)由三磷酸腺苷(ATP)降解而來，是核苷酸類的主要呈味物質(zhì)，已廣泛地應(yīng)用于食品調(diào)味中。IMP 是一種鮮味極強(qiáng)的風(fēng)味增強(qiáng)劑［14］，隨著ATP 的分解，IMP 呈上升的趨勢，一般來說1～2d 之內(nèi)達(dá)到最高濃度，并維持一段時間，這與實驗結(jié)果相一致。ATP 的快速降解與高活性的ATP 酶有關(guān)，Wataba 等［15］認(rèn)為，在低溫下肌漿網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的鈣吸收能力下降，肌原纖維內(nèi)鈣濃度增加，鈣離子激活肌原纖維Mg2+-ATP 酶，加速了ATP 的降解。由圖4 可知，在40h 之內(nèi)，IMP 均出現(xiàn)峰值，40h 之后以不同速度降解，方式Ⅰ和方式Ⅱ的降解速度較快，在50h 處低于剛宰殺時IMP 值。方式Ⅲ、Ⅳ低于剛宰殺時IMP 值2.62μmol/g，時間分別為89、150h。方式Ⅴ的IMP 含量一直處于較高水平，實驗結(jié)束仍高于剛宰殺的水平。

圖4 不同初始溫度冷誘導(dǎo)條件下羅非魚IMP 和ATP 的變化Fig.4 IMP and ATP of tilapia fillets with different initial temperature cold-induction modes

2.5 游離氨基酸的分析

表2 列出了羅非魚6 種滋味游離氨基酸及游離氨基酸總量的變化情況。就TFAA 而言，方式Ⅰ、Ⅱ均增勢平緩，方式Ⅲ、Ⅳ有比較明顯的增加，方式Ⅴ增長速度最慢。與魚宰殺后的0h 比較，在27h 處，分別增加了10.81%，10.31%，21.46%，14.87%，4.97%;在75h 處，分別增加了15.55%、13.31%、32.01%、15.01%、8.71%;在123h 處，分別增加了16.43%、19.19%、32.63%、25.36%、14.91%。以上5 種不同初始溫度的冷誘導(dǎo)方式TFAA 含量，均呈上升趨勢，方式Ⅲ、Ⅳ增勢明顯，均高于方式Ⅰ、Ⅱ和Ⅴ。魚肉的鮮美味道主要是由甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、組氨酸等氨基酸決定，實驗結(jié)果表明，在剛宰殺的羅非魚片中，天門冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸和丙氨酸這4 種主要的呈味游離氨基酸就占了測得的TFAA 的57.28%，這些成分對魚肉滋味的影響是非常明顯的。

魚類游離氨基酸與貝類相比含量較低，但是某些游離氨基酸能夠以足量高的濃度存在于魚肉中，對魚的風(fēng)味產(chǎn)生作用。在羅非魚魚片的呈味游離氨基酸中，甘氨酸和丙氨酸含量相對較高，其中甘氨酸是海鮮產(chǎn)品的主要呈味物質(zhì)，跟鮮味物質(zhì)肌苷酸、谷氨酸等有相乘作用［16］。5 種不同初始溫度的冷誘導(dǎo)方法，在27h 處比較，方式Ⅲ的甘氨酸含量最高，接近甘氨酸的閾值 130mg/100g，比原樣增加了34.18%，方式Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ分別增加了20.98%、18.65%、28.10%，方式Ⅴ增勢最小。魚貝類都含有谷氨酸，魚肉中的谷氨酸的閾值在0.03%以下，但是與死后肌肉中的肌苷酸產(chǎn)生相乘作用，所以即使含量在閾值以仍能產(chǎn)生鮮味［17］。與谷氨酸的5 種降溫方式，在27h 處基本都超過閾值5mg/100g，比原樣的增加量分別為16.04%、20.37%、23.12%、23.74%、2.89%。在75h 處的增加量分別為5.74%、30.30%、37.07%、18.65%、10.53%，方式Ⅲ谷氨酸增勢相對明顯。丙氨酸是甜味氨基酸，對魚肉的鮮味有貢獻(xiàn)［18］。5 種方式中丙氨酸的含量在21mg/100g 上下浮動，變化比較平緩。組氨酸是造成某些海產(chǎn)品肉香的特質(zhì)［18］，方式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ增加比較顯著，在27h 處比0h 處增加了69.41%、44.50%、95.22%，方式Ⅳ、Ⅴ基本沒有增長變化。

表2 羅非魚片滋味游離氨基酸組成(mg/100g)Table 2 Composition of free amino acid of tilapia fillets(mg/100g)

亮氨酸和異亮氨酸是呈苦味的氨基酸，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)亮氨酸和蛋氨酸的含量遠(yuǎn)低于它們的閾值190 和90mg/100g，并且在降溫過程中有減少趨勢。除此之外，精氨酸含量和蛋氨酸也是苦味氨基酸，精氨酸對口感的持續(xù)性和復(fù)雜性有不容忽視的作用，蛋氨酸是海膽風(fēng)味不可或缺的呈味成分［18］。

3 結(jié)論

3.1 冷誘導(dǎo)方式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ，對羅非魚鮮度影響是不同的。初始誘導(dǎo)溫度越低，K 值的增長越緩慢，鮮度越好，反之K 值增長較快，鮮度下降。

3.2 冷誘導(dǎo)方式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ，IMP 含量均在40h 內(nèi)出現(xiàn)峰值，于此同時ATP 迅速降解。

3.3 冷誘導(dǎo)方式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ，游離氨基酸總量均有所增加，不同的誘導(dǎo)方式增幅程度不同，研究發(fā)現(xiàn)冷誘導(dǎo)初始溫度為15℃，游離氨基酸增加量比較顯著。

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