李彩霞，高海寧，馬 佩，崔 瑋，吳冬青，張 勇，*

(1.河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，甘肅張掖734000;2.甘肅省高校河西走廊特色資源利用省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅張掖734000;3.河西學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，甘肅張掖734000)

花青素是一類天然存在的酚類成分，廣泛分布在水果、豆類、谷物和蔬菜中。許多研究表明，花青素有許多潛在的生物活性和藥學(xué)功能，如抗氧化［1］、抗動(dòng)脈粥樣硬化［2］、抗炎癥［3-4］等?！昂诿廊恕蓖炼故翘m州隴神公司通過航天育種選育的新品種，其秧苗是黑紫色，塊莖表皮呈黑色，肉呈紫色，富含多種營養(yǎng)型微量元素。其黑紫色是富含具有抗癌［5］、抗氧化［6］、和防止高血壓等多種保健作用的花青素。目前對(duì)黑美人土豆的研究主要在引種栽培［7］和色素穩(wěn)定性［8］及純化分離［9］方面的報(bào)道，而對(duì)其色素在機(jī)體內(nèi)生理活性研究報(bào)道較少。基于此，本研究以“黑美人”土豆為材料，對(duì)其花色素苷進(jìn)行分離純化，探討花色素苷對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)昆明衰老小鼠血清中SOD 酶活性、總膽固醇和甘油三酯以及腦、肝組織中抗氧化酶活性的影響，進(jìn)而評(píng)價(jià)“黑美人”土豆花色素苷對(duì)小鼠體內(nèi)的抗氧化作用，為進(jìn)一步開發(fā)“黑美人”土豆活性成分提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

“黑美人”土豆 購于民樂縣新天鋪，清洗泥土，冷凍備用。

谷胱甘肽過氧化氫酶(GSH-PX)測(cè)試盒、總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒、丙二醛(MDA)測(cè)試盒 購自南京建成生物工程研究所;甘油三脂試劑盒、總膽固醇試劑盒-CHO(酶法)(干粉) 北京北化康泰臨床試劑有限公司;D-半乳糖 購于sigma 公司;95%乙醇，鹽酸，NaCl 等試劑均為國產(chǎn)分析純;AB 大孔吸附樹脂 天津南開大學(xué)化工廠產(chǎn)品。

健康昆明種小鼠，體質(zhì)量(32 ±2)g，共40 只，雌雄各半，隨機(jī)分為對(duì)照組、D-半乳糖衰老模型和花色苷處理(低、中、高劑量組)5 組，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào):甘醫(yī)動(dòng)字第14-006。

多功能食品加工機(jī) 廣東洛貝電子科技有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-2000A、DHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水真空泵 鞏義市京華儀器有限責(zé)任公司;調(diào)溫型電熱套(MH-1000) 北京科偉永興儀器有限公司;AE200電子天平 Mettler Toledo 公司;CR21GⅡ高速冷凍離心機(jī) 日立公司;752N 紫外分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;LGJ-18 冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司;pro200 組織勻漿器 美國Pro Scientific 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 “黑美人”土豆花色素苷的提取與純化 “黑美人”土豆花色素苷的提取分離與純化根據(jù)文獻(xiàn)［9］操作:將洗脫收集的色素液在30～40℃減壓濃縮回收乙醇，“黑美人”土豆花色素苷濃縮液，冷凍干燥得到紫黑色粉末。最后用生理鹽水配制成低、中、高濃度色素液進(jìn)行灌胃。

1.2.2 動(dòng)物分組與D-半乳糖誘導(dǎo)衰老模型的建立 昆明小鼠40 只隨機(jī)分為5 組，即對(duì)照組，衰老模型和低、中、高花色苷劑量實(shí)驗(yàn)組，每組8 只，雌雄各半，花色苷組每天灌胃劑量為，低劑量組50mg/kg·bw、中劑量組100mg/kg·bw 和高劑量組200mg/kg·bw 的溶液，其中，模型組和色素劑量組均頸背皮下注射100mg/kg·bw D-半乳糖;對(duì)照組頸背皮下注射等體積的生理鹽水，模型組和對(duì)照組并灌胃等體積的生理鹽水，每天1 次，連續(xù)注射1 個(gè)月，并根據(jù)小鼠體重調(diào)整灌胃量，灌胃期間自由取食和飲水。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)稱量鼠的體重，并取各組小鼠摘除眼球采血分離血清，頸椎脫臼法處死動(dòng)物，分離腦、肝臟-20℃保存?zhèn)溆?。測(cè)定血清中SOD 酶活性、總膽固醇、甘油三酯及各臟器勻漿中T-AOC、SOD 酶活性和MDA 含量。

1.2.3 指標(biāo)測(cè)定 總抗氧化能力(T-AOC)、總膽固醇-CHO(酶)含量、谷胱甘肽過氧化氫酶(GSH-PX)測(cè)試盒、脂質(zhì)過氧化物(MDA)含量，測(cè)定方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，用分光光度法測(cè)定;超氧化物歧化酶(SOD)活性采用NBT 還原法測(cè)定［10］;組織蛋白含量采用Bradford 法測(cè)定［11］。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值加標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 “黑美人”土豆色素對(duì)小鼠體重的影響

由表1 可知，與處理前相比，處理后對(duì)照組小鼠體質(zhì)量有上升趨勢(shì);模型組明顯呈下降趨勢(shì);花色苷處理組呈上升趨勢(shì)，其中，高劑量組上升趨勢(shì)較為明顯;從處理前后鼠重變化值來看，模型組與對(duì)照組差異顯著(p ＜0.05)，同時(shí)模型組小鼠反應(yīng)遲鈍，毛發(fā)稀疏無光澤，在雄性小鼠中表現(xiàn)更為明顯。以上結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)用D-半乳糖誘導(dǎo)的小鼠動(dòng)物模型基本成功。

表1 “黑美人”土豆色素對(duì)小鼠體重的影響Table 1 The effect of BBPA on mice weight

2.2 “黑美人”土豆色素對(duì)小鼠血清SOD 酶活性、TC 和TG 的影響

由表2 可知，與對(duì)照相比，模型組小鼠血清中SOD 酶活性顯著降低，甘油三酯顯著升高(p ＜0.05)，而總膽固醇差異不顯著，花色素苷處理組與模型組相比較，SOD 酶活性明顯增高，TG 和TC 隨著花色苷劑量的增加呈下降趨勢(shì)，但與模型組無顯著差異。

2.3 “黑美人”土豆色素對(duì)小鼠肝臟T-AOC、GSH-Px、SOD 酶活力和MDA 含量的影響

由表3 可知，與模型組相比，不同劑量“黑美人”土豆色素處理組小鼠肝臟中T-AOC、SOD、GSH-PX酶活性呈上升趨勢(shì)，其中高、中劑量組GSH-Px 酶與模型組差異顯著(p ＜0.05)，MDA 含量呈降低趨勢(shì)，差異顯著(p ＜0.05)，但不同劑量處理組間MDA 含量差異性不顯著。

2.4 “黑美人”土豆色素對(duì)小鼠腦組織T-AOC、SOD、GSH-Px 酶活力和MDA 含量的影響

由表4 可知，與對(duì)照組相比，模型組小鼠腦組織T-AOC、SOD、GSH-Px 酶活性均呈下降趨勢(shì)，其中，GSH-Px 酶活力差異顯著(p ＜0.05)，MDA 含量升高，但差異不顯著;與模型組相比，“黑美人”土豆色素低、中、高劑量組小鼠腦組織T-AOC、SOD、GSH-PX 酶活性隨色素濃度呈上升趨勢(shì)，T-AOC、SOD、GSH-Px 酶活性色素高劑量處理組差異顯著(p ＜0.05)，模型組MDA 含量明顯高于處理，但不同劑量組間MDA 含量差異不顯著。

表2 “黑美人”土豆色素對(duì)小鼠血清SOD 酶活性、TC 和TG 的影響Table 2 The effect of BBPA on the activities of SOD，TC and TG in mice serum

表3 “黑美人”土豆色素對(duì)小鼠肝臟T-AOC、SOD、GSH-Px 酶活力和MDA 含量的影響Table 3 The effect of BBPA on the activities of T-AOC，SOD，GSH-Px and MDA content in mice liver

表4 “黑美人”土豆色素對(duì)小鼠腦T-AOC、SOD、GSH-Px 酶活力和MDA 含量的影響Table 4 The effect of BBPA on the activities of T-AOC，SOD，GSH-Px and MDA content in mice brain

3 討論與結(jié)論

亞急性衰老模型機(jī)制是指在一定時(shí)間內(nèi)，連續(xù)給動(dòng)物注射大劑量的D-半乳糖，使機(jī)體細(xì)胞內(nèi)半乳糖濃度增高，在醛糖還原酶催化下，還原成半乳糖醇，這種物質(zhì)不能被細(xì)胞進(jìn)一步代謝，而堆積在細(xì)胞內(nèi)，影響正常滲透壓，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹，功能障礙，代謝紊亂，最終導(dǎo)致衰老的發(fā)生［12］。研究發(fā)現(xiàn)，黑米花色苷、藍(lán)莓花色苷和藍(lán)靛果花色苷可以促進(jìn)TC 的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，提高了血漿中高密度脂蛋白水平，增加了肝臟對(duì)膽固醇的攝取和代謝［13-14］。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，注入D-半乳糖誘導(dǎo)的小鼠血清中TG、TC 升高，當(dāng)給予“黑美人”土豆色素后，血清中TG、TC 緩慢降低，TC差異不顯著(p ＞0.05)。由此說明，“黑美人”土豆色素對(duì)恢復(fù)D-半乳糖誘導(dǎo)衰老模型小鼠血清血脂水平具有一定的作用。

SOD 是存在于細(xì)胞液中的抗氧化酶，其活性高低間接反映了機(jī)體清除自由基的能力［15］。與模型組相比較，不同劑量處理組小鼠血清、肝臟和腦中SOD酶活性均有不同程度的提高，在這些指標(biāo)變化中，對(duì)腦組織中提高最為明顯。GSH-Px 是機(jī)體廣泛存在的催化過氧化氫或過氧化物的重要酶類，機(jī)體類GSH-Px 的下降，可使脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物增多而致衰老［16］。本結(jié)果顯示，“黑美人”土豆色素能提高D-半乳糖誘導(dǎo)的小鼠肝臟、腦組織中GSH-Px 酶的活性，其中，高劑量組與模型相比較差異顯著(p ＜0.05)。T-AOC 反映的是機(jī)體總的抗氧化能力，它的下降表明機(jī)體整體的抗氧化能力降低。D-半乳糖誘導(dǎo)后給予色素后，與模型相比較，肝臟和腦中T-AOC 有增加趨勢(shì)，在腦中中、高劑量組升高明顯(p ＜0.05)，說明花色素苷對(duì)不同的器官作用有差異。MDA 是自由基攻擊多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，常用來衡量機(jī)體氧化損傷的程度，本研究結(jié)果顯示，模型組肝臟中MDA 低于對(duì)照組，而腦中高于對(duì)照組，這一結(jié)論與文獻(xiàn)［17-19］研究相吻合。劉曉秋等［17］對(duì)D-半乳糖衰老模型大鼠的自由基代謝進(jìn)行綜合分析，發(fā)現(xiàn)腦、胃、肝臟等臟器的線粒體的生化指標(biāo)對(duì)衰老影響程度大于胞漿;Ho Shih-ching 等研究發(fā)現(xiàn)，D-半乳糖引起的氧化損傷與其濃度密切相關(guān)，且具有器官選擇性，在濃度1%和5%的半乳糖誘導(dǎo)下，小鼠血液和腦中MDA 含量增加，SOD 活性下降;而在肝臟只有5%的半乳糖誘導(dǎo)下，MDA 含量增加，且在兩個(gè)濃度下，SOD 酶活性與對(duì)照無顯著差異。半乳糖處理小鼠當(dāng)灌胃“黑美人”土豆色素后，MDA 含量與模型相比較差異顯著，各劑量組間差異不顯著，在肝臟和腦中MDA 低于模型組。MDA 含量的降低與抗氧化酶和非酶抗氧化物質(zhì)有關(guān)，其次，花色素苷是多酚羥基的黃酮類化合物，可以螯合作為自由基反應(yīng)的催化劑的過渡金屬元素如Fe、Cu 等，來抑制脂質(zhì)過氧化［20］，阻止脂質(zhì)過氧化的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，降低MDA 的生成，在一定程度上延緩衰老。

通過以上分析，不同劑量的“黑美人”土豆花色苷處理組顯著升高了小鼠體重、血清中SOD 酶活性和肝臟中GSH-Px 酶活性，以及腦中T-AOC、SOD、GSH 酶活性，同時(shí)降低了肝臟和腦中MDA 含量。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，說明“黑美人”土豆花色苷可以降低模型小鼠的氧化損傷程度，有一定的體內(nèi)抗氧化功能。但是不同因素和途徑對(duì)氧化損傷的部位和程度不同，機(jī)體抗氧化損傷的部位也有差異，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)不同部位的抗氧化酶等生化指標(biāo)也不盡相同。該研究對(duì)“黑美人”土豆活性成分的開發(fā)提供理論依據(jù)。

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