何淑鳳，李 慧，李鐵臣，孫 青

(1.皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院 婦產(chǎn)科，安徽 蕪湖 241001;2.皖南醫(yī)學(xué)院 分子生物學(xué)研究室，安徽 蕪湖 241002)

唐氏綜合征(Down syndrome，DS)，也稱21三體綜合征，是最常見的染色體數(shù)目異常性疾病，活嬰的發(fā)病率為1/1 000～1/800［1］，發(fā)病機(jī)制是由于21號染色體全部或者部分三體所導(dǎo)致的［2］，目前尚無理想的治療方法，主要通過產(chǎn)前篩查和診斷，終止妊娠而降低患兒出生率。傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)分析技術(shù)是確診21三體的金標(biāo)準(zhǔn)，但孕早期行羊水、絨毛膜穿刺可能會(huì)導(dǎo)致流產(chǎn)［3］，稍許污染可能導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)失敗［4］以及耗時(shí)長等缺點(diǎn)限制了其在臨床快速產(chǎn)前診斷中的廣泛應(yīng)用。Bili等［5］研究認(rèn)為短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat，STR)是定量檢測染色體數(shù)目異常最合適的遺傳標(biāo)記之一。因此本實(shí)驗(yàn)通過毛細(xì)血管電泳對STR分型的方法，研究21號染色體上的3個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性，從而探討一種更為快速、準(zhǔn)確的對DS患者進(jìn)行STR分型的方法。

1 對象與方法

1.1 DNA標(biāo)本 100例正常人EDTA抗凝血均來自皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院體檢中心2009年2～4月，經(jīng)體檢指標(biāo)均正常且無血緣關(guān)系的漢族個(gè)體，其中男性74例，女性26例，年齡16～63歲，平均為(37.82±10.08)歲，常規(guī)酚-氯仿抽提DNA，于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 PCR擴(kuò)增 D21S55(21q22.2)及21q22.3遠(yuǎn)端被稱為DS關(guān)鍵區(qū)(down syndrome critical region，DSCR)。選取21號染色體核心區(qū)域及其附近的3個(gè)STR位點(diǎn)(D21S11、D21S1409和 D21S1414)，根據(jù)3個(gè)STR位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)引物，上游引物5'端分別用FAM熒光標(biāo)記，引物序列來源于NCBI的UniSTS數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.n1m.nih.gov/unists/)，由上海捷瑞生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequences

反應(yīng)體系 PCR總反應(yīng)體積50μl:其中10×Buffer(含 Mg2+)5 μl，dNTP Mixture(10 mM/μl)1 μl，上下游引物各 0.5 μl，模板 DNA 2 μl，Taq 酶(Tiangen公司，2.5 U/μl)1 μl，加雙蒸水至總體積50 μl。

儀器:Mycycler型熱循環(huán)儀(Bio-Rad公司)。循環(huán)條件:98℃預(yù)變性5 min，加入Taq酶，進(jìn)入熱循環(huán)，94℃變性30 s。復(fù)性45 s(D21S11、D21S1409及D21S1414的退火溫度分別為:58℃、60℃及64℃)，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)。最后72℃延伸4 min，產(chǎn)物4℃冰箱保存。

PCR產(chǎn)物10μl加樣，1%的瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，證實(shí)有目標(biāo)帶后，拍照，產(chǎn)物-20℃避光保存。每管PCR產(chǎn)物，分成兩份，一份行6%非變性聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳，250 V預(yù)電泳30 min，4 μl PCR產(chǎn)物混合6μl上樣緩沖液，加樣，電泳3～4 h，銀染，X光讀片燈下觀察結(jié)果，拍照保存;另一份送北京諾賽基因組研究中心經(jīng)ABI Prism3730遺傳分析儀進(jìn)行STR位點(diǎn)掃描和分型。

1.3 數(shù)據(jù)處理 統(tǒng)計(jì)觀察雜合度，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0軟件包進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

二倍體個(gè)體中，單個(gè)STR基因座經(jīng)PCR擴(kuò)增和電泳圖譜分析表現(xiàn)為純合子個(gè)體只有一條帶或一個(gè)基因峰而雜合子有兩條帶或兩個(gè)基因峰。D21S11、D21S1409和D21S1414位點(diǎn)產(chǎn)物片段大小分別在223～225 bp、181～197 bp和346～350 bp之間。聚丙烯酰胺凝膠電泳分型結(jié)果見圖1～3;毛細(xì)血管電泳STR分型結(jié)果見圖4～6。

2.1 聚丙烯酰胺凝膠電泳

2.2 STR基因型圖譜

圖1 D21S11位點(diǎn)PCR產(chǎn)物6%聚丙烯酰胺電泳結(jié)果D21S11 位點(diǎn) M:200 bp;泳道1、2、3、5、6、7、8 為雜合子;4 空;9、10、11、12 為純合子Fig 1 M:200 bp;Lanes 1，2，3，5，6，7 and 8 showing the heterozygote;4:Empty;9，10，11 and 12 indicating the homozygote

圖2 D21S1409位點(diǎn)PCR產(chǎn)物6%聚丙烯酰胺電泳結(jié)果D21S1409 位點(diǎn) M:100 bp;泳道1、2、4、9、12 為純合子;3、5、6、8、10、11為雜合子;7空Fig 2 M:100 bp;Lanes 1，2，4，9 and 12 representing the homozygote;3，5，6，8，10 and 11，the heterozygote;7:Empty

圖3 D21S1414位點(diǎn)PCR產(chǎn)物6%聚丙烯酰胺電泳結(jié)果D21S1414 位點(diǎn) M:從下至上:300 bp，400 bp;泳道1、2、3、4、5、6、11、12、13 為雜合子;7、8、9、10 為純合子Fig 3 M:From bottom to up:300 bp，400 bp;Lanes 1，2，3，4，5，6，11，12 and 13 indicating the heterozygote，and 7，8.9 and 10，the homozygote

圖4 D21S11位點(diǎn)分型結(jié)果正常二倍體為雜合子時(shí)表現(xiàn)1∶1兩條帶圖譜(圖4a);為純合子表現(xiàn)為一條帶圖譜(圖4b)Fig 4 The STR result at locus D21S11Two stripes appeared in the normal heterozygote diplont sample with a dosage ratio of 1∶1(Fig 4a)，and one stripe was seen in the homozygote(Fig 4b)

圖5 D21S1409位點(diǎn)分型結(jié)果正常二倍體為雜合子時(shí)表現(xiàn)1∶1兩條帶圖譜(圖5a);為純合子表現(xiàn)為一條帶圖譜(圖5b)Fig 5 The STR result at locus D21S1409Two stripes were seen in the normal heterozygote diplont sample with a dosage ratio of 1∶1(Fig 5a)and one in the homozygote(Fig 5b)

圖6 D21S1414位點(diǎn)分型結(jié)果正常二倍體為雜合子時(shí)表現(xiàn)1∶1兩條帶圖譜(圖6a);為純合子表現(xiàn)為一條帶圖譜(圖6b)Fig 6 The STR result at locus D21S1414Two stripes were observed in the normal heterozygote diplont sample with a dosage ratio of 1∶1(Fig 6a)，and one in the homozygote(Fig 6b)

2.3 觀察雜合度 100例標(biāo)本中，用毛細(xì)血管電泳技術(shù)進(jìn)行STR位點(diǎn)分型所檢測出D21S11位點(diǎn)雜合子76例，純合子 24例，觀察雜合度為 0.76;D21S1409位點(diǎn)雜合子66例，純合子34例，觀察雜合度為0.66;D21S1414位點(diǎn)雜合子78例，純合子22例，觀察雜合度為0.78。用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測出D21S11位點(diǎn)雜合子77例，純合子23例，觀察雜合度為0.77;D21S1409位點(diǎn)雜合子65例，純合子35例，觀察雜合度為0.65;D21S1414位點(diǎn)雜合子73例，純合子27例，觀察雜合度為0.73。觀察雜合度見表2。

3 討論

有研究證實(shí)，STR在不同種族、人群之間的雜合度(observed heterozygosity，Ht)和等位基因頻率分布有一定的差異，因此可以作為一種遺傳標(biāo)記(genetic marker，GM)應(yīng)用于人類群體遺傳學(xué)及法醫(yī)學(xué)的研究［6］。對于STR位點(diǎn)遺傳多態(tài)性的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，國內(nèi)外學(xué)者有不同的判斷標(biāo)準(zhǔn)，Gill等［7］認(rèn)為當(dāng)觀察雜合度≥0.7的基因座才具有高鑒別力。國內(nèi)作者陳雁［8］則選擇雜合度超過0.62，判斷此遺傳標(biāo)記具有高度多態(tài)性。因此，在不同民族和地區(qū)研究發(fā)現(xiàn)21號染色體上高雜合度的STR位點(diǎn)，是進(jìn)行唐氏綜合征快速產(chǎn)前診斷的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)D21S11、D21S1409及 D21S1414的雜合度為:0.7600(76/100)、0.6600(66/100)和 0.7800(78/100)，我們也認(rèn)為STR位點(diǎn)雜合度≥0.7以上具有高度多態(tài)性。D21S11、D21S1414雜合度分別在0.7以上，可以作為安徽皖南地區(qū)唐氏綜合征的篩查位點(diǎn)，D21S1409雜合度在0.66，可以作為唐氏綜合征患者的輔助診斷位點(diǎn)。聯(lián)合使用多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行QF-PCR檢測非整倍體包括X，Y，21，18，13染色體其敏感性和特異性達(dá)到 100%［4］。

本實(shí)驗(yàn)通過兩種方法對D21S11、D21S1409位點(diǎn)所統(tǒng)計(jì)雜合度與本組研究人員［9］前期通過聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染方法所得雜合度不同，本實(shí)驗(yàn)D21S11位點(diǎn)雜合度0.7600(76/100)，此數(shù)據(jù)明顯高于李慧［9］等統(tǒng)計(jì)的雜合度0.4778(43/90)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，D21S1409位點(diǎn)雜合度0.6600(66/100)，與李慧［9］統(tǒng)計(jì)雜合度 0.6222(56/90)相差較小，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。究其原因，對前期部分標(biāo)本進(jìn)行再次銀染，結(jié)果發(fā)現(xiàn)原本認(rèn)為是一條帶標(biāo)本經(jīng)過再次銀染后得到的結(jié)果為兩條帶，可能是由于前期銀染過程中銀染過度所引起，從而主觀誤認(rèn)為是純合子。進(jìn)而表明，銀染方法統(tǒng)計(jì)雜合度存在一定的主觀判斷，使得堿基相差較小的兩個(gè)片段難以區(qū)別。表2為兩種方法對100例相同標(biāo)本所統(tǒng)計(jì)的觀察雜合度，D21S11、D21S1409及D21S1414位點(diǎn)兩種方法統(tǒng)計(jì)結(jié)果差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，因此PCR與毛細(xì)血管電泳技術(shù)相結(jié)合有望實(shí)現(xiàn)基因分析系統(tǒng)的全自動(dòng)化，無論對臨床診斷還是基因工程中基因片段的分離分析研究均有重要意義。

表2 觀察雜合度Tab 2 Observed Heterozygosity

毛細(xì)血管電泳進(jìn)行STR分型技術(shù)雖然有其優(yōu)越性，但對于嵌合型的21三體及純合子的患者難以診斷［10］，需要結(jié)合可以對基因組定量的技術(shù)，如依賴探針連接的多重?cái)U(kuò)增技術(shù)(MLPA)，可以通過與正常人的比較測定DNA的相對量，從而對嵌合型作出診斷，需要進(jìn)一步的研究［11］。

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