李 蓓，衣杰榮

（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306）

腐乳在發(fā)酵過程中脂肪酶活力變化研究

李 蓓，衣杰榮*

（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306）

研究了雅致放射毛霉脂肪酶的酶學(xué)特性及其脂肪酶活力在腐乳發(fā)酵過程中的變化，和對(duì)脂肪水解作用的程度。研究發(fā)現(xiàn)，雅致放射毛霉脂肪酶的最適作用溫度為40℃，最適pH為7.0。對(duì)腐乳在發(fā)酵不同階段的pH，酸值，脂肪含量以及脂肪酶活力的研究中發(fā)現(xiàn)，腐乳在毛坯階段其脂肪酶活力最高，自鹽坯階段起，脂肪酶活力一直呈下降的趨勢。而脂肪含量在白坯、毛坯和鹽坯（扣除鹽分重量）階段基本保持不變，在后期發(fā)酵階段呈現(xiàn)下降的趨勢。pH隨著后期發(fā)酵的進(jìn)行呈現(xiàn)出下降的趨勢，脂肪酸值則呈現(xiàn)出相反的趨勢，逐步上升。

雅致放射毛酶，脂肪酶活力，最適作用溫度，最適作用pH，脂肪酸值，pH，脂肪含量

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

雅致放射毛霉 Actinomucor elegans 3.27，上海工業(yè)微生物研究所，接種在馬鈴薯培養(yǎng)液中，接種量為0.5%，培養(yǎng)條件：160r/min搖床培養(yǎng)，48h。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 腐乳的制作工藝[4-6]大豆→浸泡→磨漿→煮漿→點(diǎn)漿 （鹽鹵）→壓榨→劃塊→白坯→接種 （雅致放射毛霉）→毛坯→搓毛→腌制 （NaCl≈12%）→鹽坯→鹽水清洗→灌湯裝瓶→后期發(fā)酵（30～40d）→腐乳

1.2.2 雅致放射毛酶脂肪酶特性研究

1.2.2.1 酶液的提取 用于雅致放射毛霉酶學(xué)特性研究：直接以發(fā)酵原液進(jìn)行測定。單位為μmol/（min· mL）（mL指發(fā)酵原液體積）；用于腐乳后期發(fā)酵過程中脂肪酶活力測定：2倍腐乳樣品質(zhì)量的0.15mol/L氯化鈉溶液，4000r/min下冷凍離心5min后的粗酶液。

1.2.2.2 脂肪酶活力的測定[7]PVA-橄欖油乳化液堿滴定法。

1.2.2.3 脂肪酶的最適作用pH值[8]40℃，在不同的pH值磷酸鹽緩沖液（0.02mol/L）條件下測定雅致放射毛霉脂肪酶的酶活。

1.2.2.4 脂肪酶的最適作用溫度[8]pH7.0，在不同溫度條件下測定脂肪酶的活力。

1.2.2.5 脂肪酶的pH穩(wěn)定性[8]將酶液分別置于不同pH的緩沖液中，4℃放置24h后，調(diào)節(jié)至最適pH，再測定其剩余酶活。

1.2.2.6 脂肪酶的熱穩(wěn)定性[8]將酶液置于不同溫度的恒溫水浴鍋中，精確保溫1h，然后測定其剩余酶活力。

1.2.2.7 氯化鈉濃度對(duì)酶活的影響[9]配制不同濃度的NaCl底物反應(yīng)液，于pH7和40℃的條件下，分別測定脂肪酶活力。

1.2.3 雅致放射毛酶-腐乳理化指標(biāo)測定

1.2.3.1 樣品的取樣[10]白坯取5塊，毛坯取5塊，腌坯取5塊，腐乳后酵階段，分別取5、10、15、20、30、40d的坯體和湯料樣品（4∶1），混合均勻。

1.2.3.2 pH的測定[11]酸度計(jì)法：稱取混合均勻樣品10g，加入25℃100mL蒸餾水，攪拌均勻，測pH。

1.2.3.3 脂肪酸值（酸價(jià)）的測定[12]KOH-CH3CH2OH滴定法。

1.2.3.4 脂肪的測定[13]酸水解法。

2 結(jié)果與討論

2.1 雅致放射毛酶脂肪酶酶學(xué)性質(zhì)研究

2.1.1 脂肪酶作用最適pH與酸堿穩(wěn)定性 脂肪酶活力與pH的關(guān)系如圖1所示。

圖1 雅致放射毛霉脂肪酶最適作用pH和酸堿穩(wěn)定性

酶的最適pH指酶表現(xiàn)出最大活力的pH。酶分子上有許多酸性、堿性氨基酸的側(cè)鏈基團(tuán)，隨pH的變化處于不同的解離狀態(tài)，從而直接影響酶的活性[14]。如圖1所示，雅致放射毛霉脂肪酶在中性環(huán)境中（pH 7左右）表現(xiàn)出較高的活力，在堿性環(huán)境中表現(xiàn)出的脂肪酶活力高于酸性環(huán)境中，在pH低于6.8的弱酸性環(huán)境下，隨著pH的下降，脂肪酶的相對(duì)酶活急劇下降，表明該酶對(duì)弱酸性環(huán)境很不穩(wěn)定。

從圖1中可以看出，緩沖液pH范圍在6.8～7.5之間，脂肪酶較為穩(wěn)定，24h后水解活力保持在85%以上。在酸性條件下其穩(wěn)定性較差，在pH為5.8時(shí)，脂肪酶活力只有30%左右。pH大于7.5時(shí)，脂肪酶的穩(wěn)定性呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。由此表明，雅致放射毛霉脂肪酶在中性偏堿性的條件下具有較好的穩(wěn)定性。在后面的測定雅致放射毛霉脂肪酶活力時(shí)，均取最適pH=7.0。

2.1.2 脂肪酶作用最適溫度 溫度對(duì)脂肪酶活力的影響和該酶的熱穩(wěn)定性如圖2所示。

溫度對(duì)酶活力的影響有兩個(gè)方面：當(dāng)溫度升高時(shí)，反應(yīng)速率也隨之提高，但是，當(dāng)溫度上升超過某一界限時(shí)，促使酶蛋白變性，使得酶活力喪失的速率也加快[15]。從圖2可以看出，雅致放射毛霉脂肪酶在40～50℃溫度范圍內(nèi)具有較高的酶活力，在40℃時(shí)酶活力表現(xiàn)最高，隨著作用溫度升高和降低，酶活力均呈現(xiàn)出減弱的趨勢。

圖2 雅致放射毛霉脂肪酶最適作用溫度和耐熱性

圖2所示，雅致放射毛霉脂肪酶在25～40℃溫度變化范圍內(nèi)，隨著保溫溫度的增加，相對(duì)酶活力也不斷增加，40℃以后酶活力則不斷下降，當(dāng)溫度達(dá)到60℃以上，脂肪酶的活力下降到10%左右，該脂肪酶在40～50℃之間呈現(xiàn)出良好的熱穩(wěn)定性。

肖春玲[16]報(bào)道了毛霉M2脂肪酶的酶最適溫度為50℃，在50～60℃溫度范圍內(nèi)脂肪酶活力較為穩(wěn)定，可見毛霉脂肪酶是一種較耐中高溫的酶類。

2.1.3 氯化鈉濃度對(duì)脂肪酶活力的影響 在40℃，pH7.0條件下，比較了不同濃度的NaCl對(duì)維持脂肪酶活性的作用，結(jié)果表明（圖3），NaCl濃度為0.15mol/L時(shí)，脂肪酶活力最高，為0.41U/mL。隨著NaCl濃度的增加，脂肪酶活力表現(xiàn)出逐漸減少的趨勢。前期培菌過程中使用12%（≈0.22mol/L）的氯化鈉進(jìn)行腌制，從圖中可以看出，該濃度對(duì)脂肪酶活力有一定的抑制作用（此時(shí)脂肪酶活力為0.32U/mL）。

圖3 不同氯化鈉濃度對(duì)雅致放射毛霉脂肪酶活力影響

2.2 雅致放射毛霉-腐乳在發(fā)酵過程中脂肪酶活力與脂肪水解變化探討

圖4 腐乳前期發(fā)酵過程中脂肪酶活力變化

2.2.1 發(fā)酵過程中脂肪酶活力測定 如圖4所示，白坯中的脂肪酶活力很低（主要來自于原材料中大豆本身存在的脂肪酶），毛坯階段的脂肪酶活力最高，為0.60U/mL，而鹽坯階段脂肪酶活力有所下降，為0.39U/mL。表明自白坯接種到毛坯，雅致放射毛霉在此階段產(chǎn)生了大量的脂肪酶。鹽坯（NaCl腌制）比毛坯的脂肪酶活力低，可能是由于此時(shí)的pH為7.46呈現(xiàn)出偏堿性，該pH條件下脂肪酶活力不穩(wěn)定（圖1）。同時(shí)因?yàn)樵邴}坯的腌制過程中，直接添加了相當(dāng)于毛坯重量12%（0.22mol/L）的NaCl進(jìn)行腌制，圖3顯示該濃度對(duì)于脂肪酶活力有一定的抑制作用。

腐乳后期發(fā)酵過程中脂肪酶活力變化如圖5所示，隨著后期發(fā)酵時(shí)間增加，脂肪酶活力基本呈現(xiàn)不斷下降的趨勢。這可能是因?yàn)樵诤笃诎l(fā)酵過程中腐乳的pH低于6.8，且持續(xù)下降（圖5，第5d的pH為6.71，第10d的pH為6.66，第15d的pH為6.63，到第40d的pH為6.53），而圖1中脂肪酶穩(wěn)定性的結(jié)果表明，在該pH范圍內(nèi)脂肪酶很不穩(wěn)定。

圖5 腐乳后期發(fā)酵過程中脂肪酶活力變化

圖5中可以看到，在20~25d的后酵階段，脂肪酶活力有很小的增加，與魯緋[17]報(bào)道的脂肪酶活力在整個(gè)發(fā)酵過程中表現(xiàn)出的極其不穩(wěn)定的結(jié)論不同，同樣，與全名海[18]報(bào)道的腐乳后期發(fā)酵的過程中脂肪酶活力有所增加也不相同，同時(shí)，我們用其他測定酶活力的方法進(jìn)行了驗(yàn)證，均出現(xiàn)相同的趨勢。我們推測可能是在此階段其它參與發(fā)酵的微生物如乳酸菌分泌的脂肪酶所致。這一趨勢在相關(guān)文獻(xiàn)中未見報(bào)道，需要進(jìn)一步的研究。

2.2.2 脂肪酸值（酸價(jià)）的變化 脂肪酸值是指脂肪中游離脂肪酸含量，酸價(jià)越高，表明脂肪水解程度越高[19]。腐乳在前期培菌過程中的酸價(jià)變化見圖6。

圖6 腐乳前期發(fā)酵過程中脂肪酸值的變化

圖6的數(shù)據(jù)表明，黃豆研磨成豆?jié){至形成白坯階段，其中脂肪的酸價(jià)為0.08以上，表明有一定量的游離脂肪酸產(chǎn)生，推測是由于原料中天然存在的脂肪水解酶的作用產(chǎn)生。在白坯接種成為毛坯的階段，脂肪酸價(jià)僅有少量的升高（0.003mg KOH/100g fat），而圖6表明在毛坯階段脂肪酶活力最高。這可能是由于毛坯階段盡管有大量的脂肪酶生成，但這些酶并未與坯體充分接觸而發(fā)揮作用。從圖6可以看出，腌坯階段的酸價(jià)要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于毛坯階段的酸價(jià)，表明水解主要發(fā)生在腌坯階段，可能是經(jīng)過搓毛，使脂肪水解酶與坯的接觸增加，有利于脂肪水解作用的進(jìn)行。

腐乳在后期發(fā)酵過程中酸價(jià)的變化如圖7所示。隨著后期發(fā)酵的進(jìn)行，腐乳的酸價(jià)也呈現(xiàn)出逐漸升高的態(tài)勢。表明在整個(gè)后期發(fā)酵過程中，有越來越多的游離脂肪酸生成。

圖7 腐乳在后期發(fā)酵過程中脂肪酸值的變化

2.2.3 酸度的變化 腐乳在后期發(fā)酵過程中的pH的變化見圖8。

圖8 腐乳后期發(fā)酵過程中pH值的變化

從圖8以看出，腐乳后期發(fā)酵過程中pH呈現(xiàn)平穩(wěn)而且緩慢下降的趨勢，從發(fā)酵初期的中性到發(fā)酵末期pH=6.53呈酸性，可以推斷出整個(gè)后期發(fā)酵的過程中產(chǎn)生了大量的酸，總酸的含量逐漸增多。這其中包括蛋白質(zhì)經(jīng)過蛋白酶的作用產(chǎn)生一些酸性氨基酸，同時(shí)脂肪被脂肪水解酶作用生成了游離脂肪酸和甘油（丙三醇）[20]。本研究結(jié)果與馬勇[21]的報(bào)道大致相同，但魯緋[17]在報(bào)告中指出pH最終為6.2。

2.2.4 脂肪的變化 大豆中的脂類主要包括脂肪（甘油三酯）和一些類脂類物質(zhì)，其中甘油三酯的含量占到95%，類脂類物質(zhì)占5%。腐乳在前期培菌階段和后酵階段的脂肪含量分別如圖9和圖10所示。

圖9 腐乳前期培菌過程中脂肪含量的變化

在前期培菌階段，脂肪含量的變化并不大，在腌坯的時(shí)候，添加了大量食鹽（毛坯重量的12%）后的脂肪含量為23.10%，如不將食鹽的重量計(jì)算在內(nèi)，脂肪含量=0.2310/0.87×100=26.53%，與毛坯含量相當(dāng)，可見，在毛坯、鹽坯制作過程中，脂肪含量變化很少，由此推斷整個(gè)前期培菌過程中脂肪沒有進(jìn)行代謝作用。然而，在后期發(fā)酵的階段，腐乳的脂肪含量呈現(xiàn)出下降的趨勢。在后期發(fā)酵過程中游離脂肪酸經(jīng)過各種代謝作用，變成了醛酮醇等化合物，按照本研究的脂肪含量測定方法，這些代謝產(chǎn)物不計(jì)入脂肪含量。從圖10中可以看出，第5～20d發(fā)酵過程中的脂肪含量下降趨勢相對(duì)于第20～40d的發(fā)酵階段較為明顯，這與馬勇[21]報(bào)道的大致相同。

圖10 腐乳后期發(fā)酵過程中脂肪含量的變化

3 結(jié)論

雅致放射毛霉脂肪酶最適溫度為40℃，最適pH為7.0，最適鹽濃度為0.15mol/L。在整個(gè)發(fā)酵過程中，毛坯階段的脂肪酶活力最高，為0.60U/mL，鹽坯階段脂肪酶活力有所下降，為0.39U/mL。在腐乳后期發(fā)酵過程中，脂肪酶活力與脂肪含量變化趨勢大致相同，基本都呈現(xiàn)出隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，脂肪酶活力與脂肪含量不斷減小的趨勢。然而，在第20～25d后酵階段，脂肪酶活力出現(xiàn)小幅度的增加，原因不明確，有待于進(jìn)一步的研究。pH隨著后期發(fā)酵的進(jìn)行呈現(xiàn)出下降的趨勢，而脂肪酸值則呈現(xiàn)出相反的趨勢，逐步上升。

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Evolution of lipase activity during sufu ripening process

LI Bei，YI Jie-rong*
（College of Food,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China）

Lipase characteristics,lipase activity and lipolysis of sufu fermented by Actinomucor elegans(AS)3.27 were investigated.It was found that the optimum temperature and pH of AS 3.27 was 40℃and 7.0,respectively. Lipase activity of AS 3.27 during the ripening process was determined,as well as sufu pH,acid degree value (ADV)and fat content of different stage during mature process.The results showed the highest lipase activity appeared in fresh pehtze.From the salt pehtze stage,lipase activity began to decrease.The fat content of sufu, fresh pehtze and salt pehtze(in which the salt content was excluded)were almost the same.During the ripening process,the fat content and pH decreased gradually while the acid degree value increased.

Actinomucor elegans 3.27；lipase activity；optimum temperature；optimum pH；acid degree value (ADV)；pH；fat content

TS201.3

A

1002-0306（2011）10-0261-04

雅致放射毛霉（Actinomucor elegans 3.27），異名匍匐放射毛霉，是我國目前腐乳釀造中最常用的一種菌種。腐乳在前期培菌的過程中，毛霉分泌了大量的蛋白酶和脂肪酶。在后期發(fā)酵過程中這些酶作用于腐乳坯體的脂肪、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，使之發(fā)生降解與酯化成香的化學(xué)變化，形成了腐乳獨(dú)特的色、香、味[1]。其中，腐乳的香氣主要來自于后期發(fā)酵過程中形成的大量酯類物質(zhì)，有研究者推測，在生產(chǎn)過程的前期由脂肪水解而生成游離脂肪酸，在最終階段醇與酸發(fā)生酯化作用，從而生成大量的乙酯類物質(zhì)[2]。近來，人們對(duì)于腐乳的研究主要集中在菌種的選育，多菌種混合發(fā)酵，試圖改進(jìn)腐乳的生產(chǎn)工藝[3]。然而，由于對(duì)腐乳釀造中參與酶系的特性的研究，腐乳后酵的生化過程的研究幾乎空白，使得腐乳的品質(zhì)和風(fēng)味難以有較大的改進(jìn)。在此背景下，本文結(jié)合腐乳生產(chǎn)實(shí)際，研究了雅致放射毛霉胞外脂肪酶的酶學(xué)特性，分析了腐乳發(fā)酵過程中與脂肪酸水解有關(guān)的指標(biāo)，以探討腐乳在發(fā)酵過程中脂肪的動(dòng)態(tài)變化，為將來進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)。

2010-10-21 *通訊聯(lián)系人

李蓓（1986-），女，碩士在讀，研究方向：食品加工和食品化學(xué)。