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        固定化β-半乳糖苷酶的催化特性研究

        2011-11-15 02:06:12宋景深陳振鵬鄧寶浣陳子健
        食品工業(yè)科技 2011年10期

        宋景深,陳振鵬,鄧寶浣,陳子健

        (江門量子高科生物股份有限公司,廣東江門529081)

        固定化β-半乳糖苷酶的催化特性研究

        宋景深,陳振鵬,鄧寶浣,陳子健

        (江門量子高科生物股份有限公司,廣東江門529081)

        β-半乳糖苷酶經(jīng)固定化后,其催化性能得到一定程度的改善。在各種反應條件相同的條件下,固定化酶的最適反應條件與游離酶相比得到一定程度的拓寬:受反應溫度變化的影響變小,pH從5.8~6.2擴寬至5.7~6.5;對乳糖的轉化效率有了不少的提高,酶的穩(wěn)定性也得到了加強。實驗中固定化β-半乳糖苷酶重復使用28次,底物轉化率均在45%以上,具備了一定實際應用能力。

        β-半乳糖苷酶,固定化,催化特性

        低聚半乳糖(Galactooligosaccharides,簡稱GOS)可以促進腸道內雙歧桿菌(Bifidobacteria)和乳酸桿菌等有益菌的生長,是一種益生元(prebiotics)。低聚半乳糖是以乳糖為原料,經(jīng)β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)作用轉化而成[1]??蓪ⅵ?半乳糖苷酶固定化,固定化酶具有催化效率高、穩(wěn)定性高、低能耗、低污染等優(yōu)點,將β-半乳糖苷酶固定化后用于生產(chǎn),可提高酶的利用率,節(jié)省生產(chǎn)成本。本研究中固定化酶是以樹脂為載體,經(jīng)吸附作用制作而成。酶被固定化以后,由于受到多方面的影響,與游離酶相比較,其微觀結構等往往會發(fā)生改變,對底物的轉化特性也可能隨之而變[2]。如:受擴散現(xiàn)象影響,酶固定在多孔載體,由于受到質量傳遞限制,酶活力可能會受到擴散現(xiàn)象影響;受空間構型影響,因酶的比活力非常依賴于所用載體的本身性質,另外酶固定化疏水性載體和親水性載體的差異性很大;受微環(huán)境影響,微環(huán)境是指吸附的酶分子周圍的載體性質,其可能會對酶的特性產(chǎn)生影響;受載體孔徑大小影響,載體孔徑過小,酶無法進入被吸附或者吸附后容易受到擴散限制;載體孔徑過大,酶被吸附后有可能引起酶構型的改變??梢?,酶在固定化以后可能會受到多個方面的影響,固定化酶的特性與游離酶相比較可能發(fā)生變化。本研究在以上理論基礎上,摸索β-半乳糖苷酶被樹脂固定化后的性質變化情況,觀察對乳糖轉化的特性是否受到影響,各轉化參數(shù)是否有變化。

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器

        β-半乳糖苷酶 江門量子高科生物股份有限公司;吸附樹脂 天津南開和成科技有限公司;乳糖購自戴維林國際貿易有限公司(荷蘭DMV乳糖);蒸餾水 自制;0.5mmol的氫氧化鈉溶液 自配;pH6.0緩沖液 磷酸緩沖液(自配)。

        水浴搖床 常州澳華儀器有限公司;可調電爐長沙市遠東電爐廠;三角瓶、燒杯、玻棒 購自江門國僑科技儀器公司。

        1.2 實驗方法

        轉化率檢測方法參照低聚半乳糖的高效液相色譜測定法[3],轉化率(%)以低聚半乳糖含量計。

        轉化反應的影響因素主要有底物濃度、反應液pH、反應溫度、攪拌速度等。固定化酶轉化生產(chǎn)低聚半乳糖反應條件確定主要從這些因素著手。研究中比較游離酶的各反應條件,觀察酶被固定化以后反應特性是否發(fā)生了變化。

        固定化酶的制備:用250mL三角瓶稱取3g的吸附樹脂,加入100mL蒸餾水后放入搖床,室溫條件下?lián)u動活化2h,取出后將蒸餾水倒干凈;量取10mL緩沖液(pH6.0)轉入100mL三角瓶,吸取總活力500U的液態(tài)β-半乳糖苷酶加入三角瓶,溶于緩沖液;將完成活化的樹脂倒入裝有酶液的三角瓶,然后置于6℃冷凍搖床搖動吸附,吸附24h。完成吸附后倒掉吸附殘留液,用蒸餾水將固定化酶清洗干凈。制作若干份固定化酶,存放于4℃冰箱,待用。

        1.2.1 pH對反應轉化率的影響研究 用三角瓶分別配制兩組乳糖溶液,每組各5份,干物質濃度50%±1%(50g乳糖+50mL蒸餾水),加熱完全溶解后降溫至55℃,然后使用氫氧化鈉溶液將其中4份乳糖溶液的pH調至5.0±0.1、6.0±0.1、7.0±0.1,另外一份乳糖溶液保留在自然pH(4.2),兩組操作相同,以作對比。在第一組的五份乳糖溶液中加入4mL游離酶(125U/mL),在第二組的五份乳糖溶液中加入3g固定化酶(166U/g),然后將所有乳糖溶液置于同一水浴搖床進行酶解反應,控制溫度55℃,反應過程每隔1h用氫氧化鈉溶液校對一次pH。

        1.2.2 反應溫度對轉化率的影響研究 設定四個溫度梯度:50、55、60、65℃,用三角瓶分別配制兩組乳糖溶液,每組各4份,濃度50%±1%(50g乳糖+50mL蒸餾水),加熱完全溶解,降溫至60℃后在第一組的4份乳糖溶液中加入4mL游離酶(125U/mL),在第二組的4份乳糖溶液中加入3g固定化酶(166U/g),然后分別置于50、55、60、65℃水浴搖床中。

        1.2.3 底物濃度對轉化率的影響研究 配制兩組乳糖溶液,每組各4份,濃度分別為40%±1%、45%±1%、50%±1%、55%±1%,加熱完全溶解后降溫至60℃時在第一組的4份乳糖溶液中分別加入4mL游離酶(125U/mL),在第二組的4份乳糖溶液中分別加入3g固定化酶(166U/g),兩組反應液都置于65℃水浴搖床進行反應。

        1.2.4 米氏常數(shù)Km的測定 分別在兩組4個250mL的三角瓶中用pH6.0的磷酸鹽緩沖液分別配制0.0585、0.0877、0.1170、0.1462mol/L的乳糖溶液,在兩組溶液中分別加入相同的總酶量50U的游離酶和固定化酶,在65℃下反應60min,分別測定其生成含量最高的轉移三糖的量,并計算反應速度。

        1.2.5 酶的半衰期測定 分別稱量2份游離酶和2份固定化酶,每份游離酶4mL,每份固定化酶3g,分別放入pH6.0的醋酸鹽緩沖液中,置于65℃條件下進行保溫,分別在保存的第0、5、10、15d取出一份游離酶和一份固定化酶進行酶活檢測,據(jù)此測定游離酶和固定化酶的半衰期。

        1.2.6 固定化酶使用壽命的測定 在250mL中配制固形物含量50%的乳糖溶液,加入3g固定化酶,置于65℃水浴搖床搖動反應,當反應液中GOS含量達到45%以上,停止反應;回收固定化酶,重復上述步驟,直至GOS含量低于45%。

        2 結果與討論

        2.1 pH對反應轉化率的影響

        反應16h后每隔2h分別從兩組反應液中取樣,取樣后第一組反應液升溫至100℃滅酶1min,第二組反應液用紗布濾去固定化酶,然后用高效液相色譜檢測轉化率,比較游離酶和固定化酶在不同pH條件下的乳糖轉化率,直至轉化率開始下降,停止取樣。每一份反應液都是在進行到24h后轉化率最高,當反應進一步進行,部分的低聚半乳糖將分解成單糖,而且隨著時間的推移,低聚半乳糖的損失增多。

        圖1 反應液pH對游離酶和固定化酶轉化效率的影響

        從圖1可見,酶在被固定化以后最適pH有所偏移,游離酶的最適pH為5.8~6.2,而固定化酶的最適pH為5.7~6.5,最適pH范圍更寬。另外,從圖中可見,與游離酶比較,在相同的條件下,固定化酶催化乳糖轉化的效率更高。

        2.2 反應溫度對反應轉化率的影響

        反應24h后取樣,第一組反應液升溫至100℃滅酶1min,第二組反應液用紗布濾去固定化酶,然后用高效液相色譜檢測轉化率,比較游離酶和固定化酶在不同溫度條件下的乳糖轉化率。

        圖2 反應溫度對游離酶和固定化酶轉化效率的影響

        從圖2的結果來看,隨著反應溫度的升高,在相同的反應時間內,游離酶和固定化酶對乳糖的轉化率都升高,因為所用的酶為耐高溫酶,可耐受溫度80℃以上,但考慮到載體樹脂所能耐受的溫度為65℃,設定固定化酶的最適反應溫度為65℃。固定化酶和游離酶比較,隨著反應溫度的下降,固定化酶的轉化率下降幅度較游離酶的小,從不同反應溫度角度來說,酶經(jīng)大孔樹脂固定化以后穩(wěn)定性升高,受反應溫度變化的影響較小。

        2.3 底物濃度對反應轉化率的影響

        圖3 底物濃度對反應轉化率的影響

        反應24h后分別取樣檢測低聚半乳糖含量(轉化率),觀察在不同底物濃度條件下游離酶和固定化酶的乳糖轉化率。

        從圖3可見,無論是游離酶或是固定化酶,底物濃度為40%、45%時乳糖轉化率較低,而當?shù)孜餄舛葹?0%時乳糖轉化率最高,酶的固定化酶并沒有改變此特性。而在同一條件下,固定化酶受底物的影響更低,乳糖轉化率更高。

        2.4 酶的動力學常數(shù)

        以雙倒數(shù)作圖法測定游離酶和固定化酶的米氏常數(shù)Km,如圖4,游離酶的Km=449mmol/L,Vmax= 4.560mmol·L-1·min-1;固定化酶的Km=289mmol/L,Vmax=3.605mmol·L-1·min-1。

        圖4 游離酶和固定化酶的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線

        從動力學常數(shù)來看,β-半乳糖苷酶被固定化以后,對底物的親和力更強,催化乳糖轉化成低聚半乳糖的速度被提高。

        2.5 半衰期檢測

        圖5 時間與log(E/Eo)值對應曲線

        β-半乳糖苷酶酶活檢測方法參照文獻[10]中所描述的檢測方法,根據(jù)公式計算半衰期:t1/2=0.693/KD

        式中:KD=-2.303/t·log(E/Eo),為衰減常數(shù),其中E為第5、10、15d檢測酶活平均值,Eo為第0d檢測酶活平均值。

        以時間與對應的log(E/Eo)值做標準曲線,如圖5所示。

        按照公式所計算出來的游離β-半乳糖苷酶半衰期為27d,而固定化β-半乳糖苷酶半衰期為34d,進一步證明酶被固定化以后穩(wěn)定性提高。

        2.6 固定化酶使用壽命

        游離酶因為無法回收,所以只能使用一次,而固定化酶在間歇式反應中可以通過分離來重復使用,隨著使用次數(shù)的增加,酶活力逐漸衰減。通過間歇式反應實驗的觀察,證實一批固定化β-半乳糖苷酶可反復使用28次,每次反應轉化率都在45%以上。

        3 結論

        經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),與游離酶相比較,β-半乳糖苷酶經(jīng)固定化以后,酶的最適pH范圍產(chǎn)生了偏移,從5.8~6.2擴寬至5.7~6.5,而最適反應溫度、最適底物濃度并沒有發(fā)生改變,但穩(wěn)定性比游離酶高,但在各種反應條件相同的條件下,固定化酶比游離酶反應轉化效率更高。酶在固定化以后米氏常數(shù)Km變小,從游離酶時的449mmol/L變?yōu)楣潭ɑ蟮?89mmol/L;半衰期延長,比游離酶延長了7d,說明經(jīng)固定化以后酶的特性得到了進一步改善。使用固定化酶方法生產(chǎn)低聚半乳糖,將很大程度上節(jié)省生產(chǎn)成本,提升生產(chǎn)效率,提高產(chǎn)品質量,將推動低聚半乳糖甚至低聚糖行業(yè)在我國的進一步發(fā)展。

        [1]鄭健仙.功能性低聚糖[M].北京:化學工業(yè)出版社,2004:104-109.

        [2]曹林秋.載體固定化酶-原理、應用和設計[M].北京:化工出版社,2008:53-72.

        [3]白鴻.保健食品功效成分檢測方法[M].北京:中國醫(yī)藥出版社,2011:103-110.

        Study on catalytic characteristics of immobilizated β-galactosidase

        SONG Jing-shen,CHEN Zhen-peng,DENG Bao-huan,CHEN Zi-jian
        (Quantum Hi-tech Biological Co.,Ltd.,Jiangmen 529081,China)

        Comparing to free enzyme,the catalytic characteristics of immobilizated β-galactosidase were modified.The ranges of optimum reactive conditions have been extended:the influence of temperature became smaller,pH widened to 5.7~6.5 from 5.8~6.2.The conversion rate of substrate becomes higher and the stability of enzyme has been enhanced.Having been re-used for 28 times,the conversion rate of substrate keeps being more than 45%.

        β-galactosidase;immobilization;catalytic characteristics

        TS201.2+5

        A

        1002-0306(2011)10-0092-03

        2011-08-12

        宋景深(1979-),男,研究生,食品工程師,研究方向:低聚糖生產(chǎn)技術研究。

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