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        殼聚糖抗壞血酸鹽的制備及其抗氧化性的研究

        2011-11-15 02:06:06劉靜娜莊遠(yuǎn)紅耿微微
        食品工業(yè)科技 2011年10期
        關(guān)鍵詞:抗壞血酸殼聚糖羥基

        劉靜娜,莊遠(yuǎn)紅,耿微微

        (漳州師范學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)系,福建漳州363000)

        殼聚糖抗壞血酸鹽的制備及其抗氧化性的研究

        劉靜娜,莊遠(yuǎn)紅,耿微微

        (漳州師范學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)系,福建漳州363000)

        制備了殼聚糖抗壞血酸復(fù)合鹽,并研究了抗氧化性。以殼聚糖和抗壞血酸為原料制備了復(fù)合鹽,對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征,并測定了其溶解性、穩(wěn)定性、抗氧化性等性質(zhì)。對原料配比、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行探討,發(fā)現(xiàn)最優(yōu)工藝條件為原料配比為1∶6、溫度為25℃、時(shí)間為120min,在此條件下制得的復(fù)合鹽有較好水溶性,在溶液中的穩(wěn)定性優(yōu)于抗壞血酸,清除羥基自由基的能力優(yōu)于殼聚糖,從紅外光譜圖上可看出抗壞血酸結(jié)合于殼聚糖的氨基上。該復(fù)合鹽的制備改善了其原料的性質(zhì),有利于進(jìn)一步的應(yīng)用。

        殼聚糖,抗壞血酸,抗氧化

        殼聚糖(Chitosan)是由甲殼素(Chitin)經(jīng)過脫乙?;玫降木郯被咸烟?,具有良好的生物相容性、安全性,有多種生物活性,在食品、化工、醫(yī)藥及生物醫(yī)學(xué)工程等諸多領(lǐng)域的應(yīng)用研究取得了重大進(jìn)展[1]。近年來的研究發(fā)現(xiàn),殼聚糖還是一種良好的抗氧化劑,在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,殼聚糖都表現(xiàn)出良好的對自由基的清除作用、提高體內(nèi)抗氧化酶的活性等作用[2-5]。但殼聚糖不能直接溶于水中,也不溶于一般的有機(jī)溶劑,只能溶于酸性溶液中,這在很大程度上限制了它的應(yīng)用[6]。殼聚糖大分子上分布著許多活潑的羥基、氨基,可以通過化學(xué)改性改善殼聚糖的溶解性能,進(jìn)而提高其功能活性[7]。維生素C(vitamin C),又名L-抗壞血酸(L-ascorbic acid),是含有6個(gè)碳原子的酸性多羥基化合物,也是一種人體必需的水溶性維生素??箟难峥梢蕴岣呷梭w的免疫力,增強(qiáng)人體抵抗能力,這可能與抗壞血酸是一種人體抗氧化劑有關(guān),它可以消除人體內(nèi)多余的活性氧和自由基,使人體細(xì)胞保持健康狀態(tài)[8]。殼聚糖是自然界唯一的堿性多糖,而抗壞血酸呈酸性,因此,本文制備了殼聚糖抗壞血酸復(fù)合鹽,從而改善殼聚糖不溶于水的缺點(diǎn),同時(shí)殼聚糖的大分子結(jié)構(gòu)可以保護(hù)抗壞血酸、延緩其被空氣中的氧氣氧化。此外,還對其物化性質(zhì)及抗氧化性進(jìn)行了探討,為殼聚糖的進(jìn)一步應(yīng)用提供理論基礎(chǔ),具有一定的學(xué)術(shù)意義。

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器

        殼聚糖 購自浙江金殼生物有限公司,脫乙酰度90%,粘度50cP·s;L-抗壞血酸、異丙醇、無水乙醇、冰醋酸、鄰二氮菲等 均為分析純。

        DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、DKZ-1型電熱恒溫振蕩水槽 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;UV-754分光光度計(jì) 上海第三分析儀器廠;HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市江南儀器廠;LG-D2型真空冷凍干燥機(jī) 沈陽新陽儀器設(shè)備有限公司;90-2恒溫磁力攪拌器 上海亞榮生化儀器廠。

        1.2 實(shí)驗(yàn)方法

        1.2.1 殼聚糖抗壞血酸鹽的制備 在500mL的三口燒瓶中加入150mL異丙醇和50mL水配制異丙醇水溶液,稱取一定量的抗壞血酸并以異丙醇水溶液溶解,再加入一定量的殼聚糖,將燒瓶放入振蕩器中,在一定溫度下恒溫振蕩一定時(shí)間。反應(yīng)結(jié)束后,將反應(yīng)體系進(jìn)行抽濾、洗滌,然后將濾餅進(jìn)行真空冷凍干燥,最后得到產(chǎn)物。選擇反應(yīng)配比(殼聚糖的-NH2和抗壞血酸的摩爾比),反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度進(jìn)行殼聚糖抗壞血酸鹽制備的三因素三水平正交實(shí)驗(yàn),因素水平見表1。

        表1 制備殼聚糖抗壞血酸鹽的因素水平表

        1.2.2 殼聚糖抗壞血酸鹽中有效Vc含量的測定 分別準(zhǔn)確稱取抗壞血酸0.025、0.05、0.075、0.1、0.125g,溶于0.1mol/L的鹽酸溶液中,用紫外分光光度計(jì)在242.5nm處測其吸光度,并制作其標(biāo)準(zhǔn)曲線[9-10]。

        圖1 抗壞血酸含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

        取按不同因素水平制備的抗壞血酸鹽產(chǎn)物0.1g溶于0.1mol/L的鹽酸中,用紫外分光光度計(jì)在242.5nm處測其吸光度,計(jì)算殼聚糖抗壞血酸鹽中有效Vc含量。

        1.2.3 產(chǎn)物結(jié)構(gòu)表征 取殼聚糖原料及殼聚糖抗壞血酸鹽產(chǎn)物,用KBr壓片后在傅立葉紅外儀(FTIR)上進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。

        1.2.4 溶解性的測定 取制得的適量(0.1g)殼聚糖抗壞血酸鹽置于試管,加10mL去離子水、HCl(1%)、乙酸(1%)、丙酮、乙醇溶劑,放入振蕩培養(yǎng)箱中振蕩24h,觀察其溶解現(xiàn)象。

        1.2.5 穩(wěn)定性的測定 將純L-抗壞血酸和殼聚糖抗壞血酸鹽分別溶解在pH=4.8的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液、蒸餾水、pH=10.0的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖溶液,在室溫下放置,定期測定其最大吸收波長處的吸光度值[9]。

        1.2.6 對羥基自由基的清除 采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法[11]。計(jì)算不同樣品對·OH的清除率:

        式中:A樣為樣品組的吸光值;A損為損傷管的吸光值;A未損為未損傷管的吸光值。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 殼聚糖抗壞血酸鹽的制備

        抗壞血酸容易失去活性,在60℃以上就會(huì)分解,所以選擇比較溫和的實(shí)驗(yàn)條件來制備殼聚糖抗壞血酸鹽,反應(yīng)時(shí)間也不宜過長。通過反應(yīng)配比、反應(yīng)時(shí)間和溫度三因素的水平變化來討論其對殼聚糖抗壞血酸鹽有效Vc含量和溶解性的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

        表2 殼聚糖抗壞血酸鹽制備的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        從表2中可以看出,反應(yīng)時(shí)間延長有助于提高產(chǎn)物殼聚糖抗壞血酸鹽中有效Vc含量;而且抗壞血酸的濃度越大,有效Vc含量也就越大;但在一定溫度范圍內(nèi),抗壞血酸的活性會(huì)隨著溫度升高而被破壞,因此25℃時(shí)比40℃時(shí)反應(yīng)得到的產(chǎn)物抗壞血酸含量更高。由結(jié)果分析可知,制備殼聚糖抗壞血酸鹽的最優(yōu)條件組合為A2B1C3或A3B1C3,后者即為實(shí)驗(yàn)7的條件組合,從表中可看出,該條件下所制得的產(chǎn)品中有效Vc含量最高,因此最終確定反應(yīng)配比1∶6,溫度25℃,時(shí)間120min為最佳反應(yīng)條件,此時(shí)反應(yīng)程度最高,產(chǎn)物中有效Vc含量最大,而且該產(chǎn)物在水中可以全部溶解。由極差分析可知,對正交結(jié)果的影響為溫度>配比>時(shí)間,即溫度對殼聚糖抗壞血酸鹽的制備影響最大,配比次之,時(shí)間影響最小。

        2.2 殼聚糖抗壞血酸鹽的紅外表征

        圖2 殼聚糖及殼聚糖抗壞血酸鹽的紅外光譜圖

        將殼聚糖及殼聚糖抗壞血酸鹽用紅外光譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征,結(jié)果如圖2所示。從圖中可知,經(jīng)過成鹽反應(yīng)后,3428cm-1處的N-H伸縮峰由原來的尖而窄變得鈍而寬,表明抗壞血酸通過殼聚糖的-NH2鍵進(jìn)行結(jié)合。在殼聚糖抗壞血酸鹽的譜圖中,增加了1032cm-1和1062cm-1的峰,這是C-O伸縮振動(dòng),表明結(jié)合上了抗壞血酸分子。

        2.3 殼聚糖抗壞血酸鹽的溶解性

        將殼聚糖原料及產(chǎn)品殼聚糖抗壞血酸鹽溶解于水、鹽酸及常用有機(jī)溶劑,結(jié)果如表3所示。結(jié)果表明,殼聚糖抗壞血酸鹽在水溶液中的溶解性比殼聚糖原料提高很多,能完全溶于水;在稀鹽酸和乙酸這兩種酸性溶劑中的溶解速度也大大加快,但是在常用有機(jī)溶劑中仍然不溶解。殼聚糖抗壞血酸復(fù)合鹽的水溶性使其在食品和營養(yǎng)領(lǐng)域的應(yīng)用范圍大大拓寬。

        表3 殼聚糖及殼聚糖抗壞血酸鹽的溶解性

        2.4 不同pH環(huán)境中殼聚糖抗壞血酸鹽的穩(wěn)定性

        2.4.1 純L-抗壞血酸濃度隨靜置時(shí)間的變化 將分別溶于水、乙酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液的L-抗壞血酸溶液在室溫下靜置,定時(shí)測定其最大吸收波長處的吸光度,以觀測Vc濃度隨時(shí)間的變化情況,結(jié)果如圖3所示。由圖可知,Vc在pH=10.00的碳酸鹽緩沖體系中濃度變化速度最快,平均每分鐘下降1.3%;而在水中和在pH=4.8的乙酸鹽緩沖液中吸光度值下降趨勢幾乎相同,下降速率分別約為0.5%/min和0.44%/min。

        圖3 純L-抗壞血酸在不同pH下靜置時(shí)間對Vc濃度的影響

        2.4.2 殼聚糖抗壞血酸鹽濃度隨靜置時(shí)間的變化 將殼聚糖抗壞血酸鹽分別溶于pH為4.8、7.0和10.0的溶液中,觀測其中有效Vc含量隨時(shí)間的變化。由圖4可以看到,殼聚糖抗壞血酸鹽在水體系中最不穩(wěn)定,Vc濃度每天下降最快;而在pH=10.00的碳酸鹽緩沖體系中下降次之,在pH=4.8的乙酸鹽緩沖液中每天下降則為最慢。

        圖3和圖4反映的是Vc在不同pH體系中的穩(wěn)定性,純L-抗壞血酸在水中的穩(wěn)定時(shí)間不超過3h,即使是在pH=4.8的乙酸鹽緩沖液中也不過數(shù)小時(shí)。而對殼聚糖抗壞血酸鹽而言,穩(wěn)定性有所提高,在pH=4.8的乙酸鹽緩沖液中一周內(nèi)都未觀察到明顯的分解,在水和pH=10.00的碳酸鹽緩沖體系中要完全分解也至少需要一周的時(shí)間。這是因?yàn)榭箟难岢甥},對酸、氧的穩(wěn)定性大大提高,殼聚糖與抗壞血酸反應(yīng)成鹽,保護(hù)了其抗氧化性。結(jié)果表明了殼聚糖抗壞血酸鹽穩(wěn)定性明顯高于純L-抗壞血酸。

        圖4 殼聚糖抗壞血酸鹽在不同pH下靜置時(shí)間對Vc濃度的影響

        2.5 殼聚糖抗壞血酸鹽對羥基自由基的清除

        圖5 原料和產(chǎn)物對羥基自由基的清除效果

        羥基自由基是自由基對人體造成損傷,導(dǎo)致人體衰老的重要原因之一,其損害作用主要體現(xiàn)在對生命大分子的損害。羥基自由基是已知的最強(qiáng)氧化劑,可以與幾乎所有的細(xì)胞成分發(fā)生反應(yīng),對機(jī)體危害極大,與衰老、腫瘤等密切相關(guān)[12]。不同濃度的殼聚糖、抗壞血酸及殼聚糖抗壞血酸鹽對羥基自由基(·OH)清除作用的結(jié)果見圖5。由圖可知,隨著濃度的升高,抗壞血酸及殼聚糖抗壞血酸鹽對羥基自由基的清除能力增強(qiáng)較明顯,其半抑制濃度IC50(當(dāng)清除率達(dá)到50%時(shí),所需自由基清除劑的濃度)分別為0.38、0.39mg/mL,二者之間的羥基自由基清除能力大致相同,而殼聚糖原料對羥基自由基的清除能力相對較差。由此可見殼聚糖與抗壞血酸反應(yīng)成鹽后,殼聚糖起到了很好地保護(hù)抗壞血酸的載體作用,并未影響其抗氧化能力,而且增強(qiáng)了殼聚糖本身的抗氧化能力。

        3 結(jié)論

        本文利用殼聚糖在異丙醇介質(zhì)中與抗壞血酸進(jìn)行反應(yīng),在原料配比1∶6,溫度25℃,時(shí)間120min的最優(yōu)工藝條件下,制備了水溶性較好的殼聚糖抗壞血酸鹽。對產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)用紅外光譜進(jìn)行表征,表明抗壞血酸結(jié)合在殼聚糖的活性氨基上。對產(chǎn)物的物化性質(zhì)進(jìn)行了測定,表明產(chǎn)物的水溶性和對羥基自由基的清除能力都優(yōu)于原料殼聚糖;穩(wěn)定性優(yōu)于原料抗壞血酸。該結(jié)果表明,殼聚糖與抗壞血酸結(jié)合之后,產(chǎn)物的性能得到了改良,將更有利于其在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用,具有較高的使用價(jià)值。

        [1]蔣挺大.甲殼素[M].北京:中國環(huán)境科學(xué)出版社,1999:376.

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        Study on preparation and antioxidation of chitosan-ascorbic acid compound

        LIU Jing-na,ZHUANG Yuan-hong,GENG Wei-wei
        (Department of Biological Sciences and Biotechnology,Zhangzhou Normal University,Zhangzhou 363000,China)

        Chitosan-ascorbic acid compound was prepared and its antioxidation was studied.The compound was prepared with chitosan and ascorbic acid,and the structure,solubility,stability and antioxidation were determined.The optimal technology was 1∶6 of material ratio,25℃ of temperature and 120min of time.The compound prepared under this condition showed better solubility and hydroxyl free radical scavenging ability than chitosan,and better stability in the solution than ascorbic acid.Infrared spectrum exhibited that ascorbic acid bound with the amino group.The product improved the ability of materials,which was good to the further application.

        chitosan;ascorbic acid;antioxidation

        TS201.2

        A

        1002-0306(2011)10-0139-04

        2011-07-29

        劉靜娜(1980-),女,博士,講師,主要從事生物活性物質(zhì)與功能性食品的研究。

        福建省青年科技人才創(chuàng)新項(xiàng)目(2009J05038);漳州師范學(xué)院博士啟動(dòng)課題項(xiàng)目(L20812)。

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