董迅衍, 徐大慶, 李燁, 李江華, 王小元＊

(1.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室,江南大學(xué),江蘇無錫 214122;2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院,江蘇無錫 214122)

乳糖發(fā)酵短桿菌lysC突變對L-賴氨酸積累的影響

董迅衍1, 徐大慶1, 李燁1, 李江華2, 王小元＊1

(1.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室,江南大學(xué),江蘇無錫 214122;2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院,江蘇無錫 214122)

從一株乳糖發(fā)酵短桿菌L-異亮氨酸生產(chǎn)菌中克隆出天冬氨酸激酶A K-1的編碼基因lysC1,經(jīng)DNA測序并與來自谷氨酸棒桿菌A TCC13032的野生型lysC比對發(fā)現(xiàn)其中有2個核苷酸1186G和1187C缺失,造成翻譯提前終止。A K-1還有下列2個有效突變位點:A la 279 Thr和Ser 317 A la。lysC1在大腸桿菌BL21中的誘導(dǎo)表達量約為lysC的1/4,其表觀比酶活也較低,但對L-蘇氨酸和L-賴氨酸協(xié)同反饋抑制不敏感。用大腸桿菌-黃色短桿菌穿梭表達載體pDXW-8將lysC1在野生型乳糖發(fā)酵短桿菌A TCC13869中誘導(dǎo)型表達,經(jīng)搖瓶發(fā)酵積累L-賴氨酸7.4 g/L,在3 L發(fā)酵罐上達40 g/L。

乳糖發(fā)酵短桿菌;天冬氨酸激酶;抗反饋抑制;發(fā)酵;L-賴氨酸

L-賴氨酸為高等動物必需的8種氨基酸之一,在飼料、食品、醫(yī)藥行業(yè)應(yīng)用廣泛,主要被用作動物飼料添加劑,是畜禽飼料的第一限制性氨基酸[1]。以添加了賴氨酸的低蛋白質(zhì)配方飼料作為畜禽日糧,不但可以節(jié)省飼養(yǎng)成本,增強動物的免疫功能,提高畜禽的生產(chǎn)性能;還可以緩解天然蛋白質(zhì)的匱乏,減少動物氨的排放,從而使環(huán)境收益與經(jīng)濟收益相統(tǒng)一[2]。

目前,L-賴氨酸主要采用微生物直接發(fā)酵法生產(chǎn),生產(chǎn)菌種多為棒狀桿菌,其中以親緣關(guān)系相近的谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)、乳糖發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)為主。這些菌株屬格蘭氏陽性菌株,由于其天冬氨酸族氨基酸(包括:賴氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸)合成途徑上不存在同功酶,調(diào)控機制相對簡單,因此適合用于天冬氨酸族氨基酸生產(chǎn)菌種的選育與構(gòu)建。天冬氨酸激酶(aspartate kinase,A K)是天冬氨酸族氨基酸合成途徑上第一個關(guān)鍵酶,起控制進入天冬氨酸族氨基酸合成途徑總碳流量的作用。L-天冬氨酸經(jīng)天冬氨酸激酶和天冬氨酸半醛脫氫酶兩步酶催化反應(yīng)后,即進入L-賴氨酸合成支路:經(jīng)7步(有機氮源情況下)或者4步(NH4+存在時)酶催化反應(yīng)最終生成L-賴氨酸[3]。A K由lysC基因編碼,野生型受終產(chǎn)物L(fēng)-賴氨酸和L-蘇氨酸的協(xié)同反饋抑制。通過對一些經(jīng)傳統(tǒng)育種方法選育得到的賴氨酸生產(chǎn)菌進行組學(xué)研究分析,發(fā)現(xiàn)A K是該合成途徑上影響賴氨酸產(chǎn)量的3個關(guān)鍵酶之一[4,5]。

作者從一株乳糖發(fā)酵短桿菌L-異亮氨酸生產(chǎn)菌中克隆到一個編碼抗反饋抑制A K-1的基因lysC1,測序確定了其中的突變位點。將lysC1轉(zhuǎn)入野生型乳糖發(fā)酵短桿菌ATCC13869中表達,發(fā)酵實驗結(jié)果表明L-賴氨酸產(chǎn)量大幅提高。本研究為構(gòu)建具有最少突變位點、遺傳背景明確、生長旺盛的優(yōu)勢L-賴氨酸生產(chǎn)菌株提供了一定的參考依據(jù),也為構(gòu)建其他天冬氨酸族氨基酸生產(chǎn)菌株提供了重要信息。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 乳糖發(fā)酵短桿菌ATCC13869購自美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(ATCC);大腸桿菌(Escherichia coli)JM 109、BL21,乳糖發(fā)酵短桿菌L-異亮氨酸生產(chǎn)菌以及質(zhì)粒p ET28a由本實驗室保藏;大腸桿菌-黃色短桿菌穿梭表達載體pDXW-8:作者所在實驗室構(gòu)建[6]。

1.1.2 主要試劑和儀器 限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker和ATP:上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品;PrimeStar DNA聚合酶和 PCR試劑:TaKaRa寶生物公司產(chǎn)品;引物合成:上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品;瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和基因組提取試劑盒:北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品;質(zhì)粒小量制備試劑盒:Bio Basic Inc產(chǎn)品;IPTG:Sigma公司產(chǎn)品;酵母粉和胰蛋白胨:Oxoid公司產(chǎn)品;其余試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

PCR儀:Eppendo rf AG產(chǎn)品;電泳儀:北京六一公司產(chǎn)品;紫外分光光度計:日本島津產(chǎn)品;電轉(zhuǎn)儀:BioRad公司產(chǎn)品;核酸-蛋白定量儀:Gene Quant公司產(chǎn)品;高壓細胞破碎儀:Constant System s公司產(chǎn)品;高效液相色譜:Agilent公司產(chǎn)品;3 L發(fā)酵罐:New Brunsw ick Scientific公司產(chǎn)品。

1.1.3 培養(yǎng)基 大腸桿菌用LB培養(yǎng)基;乳糖發(fā)酵短桿菌A TCC13869用添加了質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%葡萄糖的LB培養(yǎng)基;乳糖發(fā)酵短桿菌L-異亮氨酸生產(chǎn)菌用添加了質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%葡萄糖和0.5%牛肉浸膏的LB培養(yǎng)基。種子培養(yǎng)基各組成質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為:葡萄糖2.5%,尿素0.125%,玉米漿2.0%,KH2PO40.1%,M gSO40.05%,p H 7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基組成質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為:葡萄糖8%,(N H4)2SO43.5%,玉米漿 2.0%,KH2PO40.1%,M gSO40.1%,CaCO33.0%,p H 7.0。

1.2 方法

1.2.1 菌體培養(yǎng)及發(fā)酵 大腸桿菌培養(yǎng)溫度為37℃,乳糖發(fā)酵短桿菌為30℃;需要時,在培養(yǎng)基中添加30 mg/L卡那霉素。

發(fā)酵種子培養(yǎng):挑一滿環(huán)新鮮斜面上的菌體接種至種子培養(yǎng)基,在30℃,250 r/min條件下培養(yǎng)15 h。種子液按質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%接種量轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基。

搖瓶發(fā)酵:裝液量為50 m L/500 mL;分別于接種后27、51、75 h共3個時間點添加 IPTG(終濃度為30μmol/L)誘導(dǎo)。

上罐:裝液量為罐體積的60%;分別于接種后18、36、54 h共3個時間點添加 IPTG(終濃度為30

μmol/L)誘導(dǎo)[7]。罐上溶氧控制為初期30%,對數(shù)生長期50%,穩(wěn)定期30%。流加體積分?jǐn)?shù)25%氨水和2 mol/L HCL以控制p H值在7.0。流加葡萄糖以維持糖質(zhì)量濃度在10～15 g/L[8]。

1.2.2 PCR擴增lysC和lysC1 根據(jù)谷氨酸棒桿菌A TCC13032lysC基因的上下游序列設(shè)計兩套PCR引物,F1/R1和 F2/R2,分別用于在載體p ET28a和pDXW-8中表達。正向引物F1的序列為:5’-ACTAGAA TTC GTGGCCCTGGTCGTACAGAAA TA-3’,其中下劃線表示 EcoRⅠ酶切位點;反向引物 R1的序列為:5’-ACTAGCGGCCGCGCGTCCGGTGCCTGCA TAAA-3’,其中下劃線表示NotⅠ位點。正向引物 F2的序列為:5’-AGTCGAA TTCAGAA GGA GTTTTACC GTGGCCCTGGTCGTACAGAA-3’,其中下劃線表示EcoRⅠ酶切位點,斜體字表示 SD序列,黑體表示間隔序列;下游引物 R2的序列為:5’-ACTAGCGGCCGCTTAGCGTCCGGTGCCTGCA TAAA-3’,其中下劃線表示NotⅠ位點。以乳糖發(fā)酵短桿菌A TCC13869基因組為模板PCR擴增野生型lysC;以L-異亮氨酸生產(chǎn)菌基因組為模板,PCR擴增突變型lysC1。

PCR擴增條件:首先在95℃預(yù)變性5 min;接著進行35個循環(huán)(95℃30 s,65℃15 s,72℃2 min);最后在72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物通過膠回收純化。

1.2.3 構(gòu)建表達質(zhì)粒和重組菌 首先用限制性內(nèi)切酶 EcoRⅠ和NotⅠ分別對基因lysC、lysC1和載體p ET28a、pDXW-8進行處理,將處理后的載體與基因片段用 T4 DNA連接酶連接,將連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM 109,篩選陽性克隆。將篩選得到的p ET28a-lysC和p ET28a-lysC1分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21,得到轉(zhuǎn)化子;將篩選得到的pDXW-8-lysC1和pDXW-8分別轉(zhuǎn)入乳糖發(fā)酵短桿菌A TCC13869,得到轉(zhuǎn)化子。大腸桿菌用CaCl2法轉(zhuǎn)化,乳糖發(fā)酵短桿菌用電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化[6];均用卡那霉素抗性平板篩選陽性克隆。其中,p ET28a-lysC1中l(wèi)ysC1的序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測定。

1.2.4 粗酶液制備 分別挑取大腸桿菌BL 21/p ET28a-lysC和BL21/p ET28a-lysC1在新鮮平板上的單菌落接種至LB液體培養(yǎng)基,在37℃和200 r/min過夜培養(yǎng)。按體積分?jǐn)?shù)1%接種量轉(zhuǎn)接新的LB液體培養(yǎng)基,培養(yǎng)至A600為0.6,添加 IPTG(終濃度為1 mmol/L)誘導(dǎo)表達,繼續(xù)培養(yǎng)5 h,收集菌體,離心,棄上清。菌體用緩沖液(20 mmol/L Tris-Cl,500 mmol/L(NH4)2SO4,150 mmol/L NaCl)[9]重懸,洗滌,離心后再重懸于3倍菌體體積的緩沖液,用高壓細胞破碎儀破碎。在12 000 r/min離心30 m in,取上清,用同樣緩沖液進行透析后,超濾濃縮,即得粗酶液。粗酶液中蛋白采用Bradford法定量,以小牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.5 A K酶活測定 采用0.7 m L的反應(yīng)體系,其中含有10 mmol/L M gSO4,10 mmol/L L-天冬氨酸,10 mmol/L A TP,0.6 mol/L羥胺和適量粗酶液。從加入酶液開始計時,在30℃反應(yīng)1 h后,加入0.7 mL反應(yīng)終止液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%FeCl3·6H2O,體積分?jǐn)?shù) 3.3%三氯乙酸,0.7 mol/L HCl),離心,取上清液在540 nm紫外波長下測吸光值(ε=600 L/(cm·mol))[9]。以加入酶液后立即加反應(yīng)終止液為空白對照;以不外加底物天冬氨酸作為參照,監(jiān)測透析是否完全。鑒定抗反饋抑制特性時,在反應(yīng)體系中分別添加5 mmol/L L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-蘇氨酸和L-賴氨酸。單位比酶活(U)定義為:1 mg酶蛋白在1 min內(nèi)催化足量底物生成1μmol產(chǎn)物。

1.2.6 乳糖發(fā)酵短桿菌菌體量的測定 吸取0.1 m L的發(fā)酵液,加入5 mL蒸餾水稀釋,采用紫外分光光度計測定562 nm波長下的吸光度。

1.2.7 氨基酸含量測定 采用高效液相色譜系統(tǒng)(HPLC)自動柱前衍生化法測定。所用色譜柱為Agilent Eclip se-AAA柱。采用流動相組成為水相(1 L):4.52 g無水乙酸鈉,200μL三乙胺,5 m L四氫呋喃,p H 7.2;有機相(1 L):4.52 g無水乙酸鈉,400 m L甲醇,400 m L乙腈。色譜條件:柱溫40℃,流量1.0 mL/min,DAD檢測器。

2 結(jié)果與討論

2.1 lysC和lysC1的PCR擴增及其表達質(zhì)粒的構(gòu)建

以乳糖發(fā)酵短桿菌A TCC13869和L-異亮氨酸生產(chǎn)菌基因組為模板,用引物 F1/R1分別擴增出lysC和lysC1(1 266 bp)。以L-異亮氨酸生產(chǎn)菌基因組為模板,用引物 F2/R2擴增出lysC1。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測,在1 000～1 500 bp間有目的條帶。將從大腸桿菌JM 109陽性克隆提出的質(zhì)粒p ET28a-lysC、p ET28a-lysC1、pDXW-8-lysC1 用EcoRⅠ酶切驗證,通過瓊脂糖凝膠電泳驗證了質(zhì)粒大小,通過測序得到基因序列。

2.2 lysC1的突變位點

共隨機選取6個大腸桿菌JM 109陽性克隆,從中提取質(zhì)粒進行測序。測得的lysC1序列一致。通過Blast比對,發(fā)現(xiàn)lysC1與谷氨酸棒桿菌A TCC13032lysC有22個堿基差異,導(dǎo)致2個有義氨基酸突變位點A la 279 Thr和 Ser 317 A la。此外,lysC基因的1186G和1187C在lysC1中缺失。

2.3 lysC和lysC1在 E.coli BL21中的誘導(dǎo)表達

以p ET28a為載體,lysC和lysC1均可以在大腸桿菌BL21中進行誘導(dǎo)表達。如圖1所示,在相對分子質(zhì)量44 300～66 400間可見清晰表達條帶,野生型A K與文獻報道一致[10],lysC1表達的A K-1與預(yù)測蛋白質(zhì)大小吻合。加上載體N端和C端的His-Tag,A K大小為49 200;加上載體N端的His-Tag,A K-1大小為46 000。A K的表達量明顯高于A K-1,約是4倍關(guān)系。這可能因為lysC1的高拷貝數(shù)表達造成了胞內(nèi)中間代謝產(chǎn)物的過量積累,影響細胞生長,進而影響了lysC1的表達[11]。

圖1 lysC和lysC1在大腸桿菌BL21中的誘導(dǎo)表達Fig.1 Expression of lysC and lysC1 in E.coli BL21 after IPTG induction

2.4 野生型AK和突變型AK-1的酶活比較

無抑制劑存在的情況下,測得的突變型A K-1酶活低于野生型A K(表1);但由于A K-1在大腸桿菌BL21中的誘導(dǎo)表達量約為A K的1/4,所以以粗酶液總蛋白質(zhì)定量測得的表觀比酶活(umol/m in·mg總蛋白質(zhì))并不能說明A K-1活性低于A K。

在5 mmo l/L抑制劑存在時,A K輕度受賴氨酸抑制,幾乎不受蘇氨酸抑制,但受賴氨酸和蘇氨酸協(xié)同反饋抑制;A K-1受賴氨酸抑制程度較野生型輕,不受蘇氨酸抑制,33%酶活受賴氨酸、蘇氨酸協(xié)同反饋抑制。

表1 AK和AK-1的比酶活Tab.1 Specific activities of AK and AK-1

2.5 過表達lysC1對乳糖發(fā)酵短桿菌L-賴氨酸積累的影響

以大腸桿菌-黃色短桿菌穿梭質(zhì)粒pDXW-8為載體,在乳糖發(fā)酵短桿菌A TCC13869中過表達lysC1,通過發(fā)酵實驗研究其對菌株產(chǎn)酸的影響。

圖2 乳糖發(fā)酵短桿菌搖瓶發(fā)酵90 h對產(chǎn)酸影響Fig.2 90 h flask fermentation of B.lacto fermentum strains

如圖2(a)所示,在搖瓶發(fā)酵過程中,重組菌與出發(fā)菌株以及轉(zhuǎn)入空質(zhì)粒的對照菌株生長情況相近,無明顯受阻現(xiàn)象,說明質(zhì)粒的轉(zhuǎn)入及l(fā)ysC1的過表達未對細胞造成大的負擔(dān)。發(fā)酵90 h后,用HPLC分析檢測發(fā)酵液中氨基酸的的種類與含量,發(fā)現(xiàn)L-賴氨酸積累量增長最大,達到7.4 g/L,分別是初始菌株A TCC13869和對照菌株A TCC13869/pDXW-8的37和49倍(圖2(b))。而發(fā)酵液中丙氨酸的含量明顯下降,從3.44 g/L降至1.95 g/L,說明lysC1的過表達有效地將中心碳代謝流引入了天冬氨酸族賴氨酸合成途徑。此重組菌在3 L發(fā)酵罐上,發(fā)酵72 h后,產(chǎn)L-賴氨酸可達40 g/L。

3 結(jié) 語

A K是整個天冬氨酸族氨基酸合成途徑上第一個關(guān)鍵酶,控制著用于合成天冬氨酸族氨基酸的碳流量,對于構(gòu)建L-賴氨酸、L-甲硫氨酸、L-蘇氨酸、L-異亮氨酸高產(chǎn)菌株都具有重要意義。作者從一株乳糖發(fā)酵短桿菌L-異亮氨酸生產(chǎn)菌中克隆到一個編碼抗反饋抑制A K-1的lysC1基因,經(jīng)測序比對,發(fā)現(xiàn)了新的與抗反饋抑制特性相關(guān)的突變位點。A K-1部分解除了L-蘇氨酸和L-賴氨酸的協(xié)同反饋抑制。而野生型A K受抑制情況與文獻報道一致:受蘇氨酸和賴氨酸協(xié)同反饋抑制,略受賴氨酸抑制,幾乎不受蘇氨酸抑制[13]。在乳糖發(fā)酵短桿菌A TCC13869中,利用中等拷貝數(shù)的大腸桿菌-黃色短桿菌穿梭質(zhì)粒pDXW-8過表達lysC1,L-賴氨酸產(chǎn)量可達40 g/L,而經(jīng)多輪誘變得到的L-賴氨酸生產(chǎn)菌的最高產(chǎn)量僅為77～82 g/L[14]。這充分說明本研究發(fā)現(xiàn)的突變位點在L-賴氨酸合成中起著十分重要的作用。這些突變與已報道的與A K抗反饋抑制有關(guān)的突變位點Ser 381 Phe、Thr 311 Ile、Ser 301 Tyr/Phe 和 Thr 279 Pro[3,10,12]為構(gòu)建具有遺傳背景明確的賴氨酸高產(chǎn)菌奠定了基礎(chǔ)。

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The Effect of LysC on L-Lysine Accumulation in
B revibacterium lactofermentum

DONG Xun-yan1, XU Da-qing1, LI Ye1, LI Jiang-hua2, WANG Xiao-yuan＊1
(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi214122,China;2.School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

The genelysC1 encoding aspartate kinase A K-1 from aB revibacterium lactofermentumL-isoleucine producer was sequenced. Compared with thelysCfromCorynebacterium glutamicumA TCC13032,there were deletions of two nucleotides 1186G and1187C,leading to the pre-termination of translation.In addition,the following two mutated sites were also identified in lysC1:A la 279 Thr and Ser 317 A la.InEscherichia coliBL21,the expression level oflysC1 was lower than that oflysCfromB.lactofermentumA TCC13869.The A K-1 had a lower apparent value of specific activity than the wild type A K,but it was not sensitive to the feedback inhibition by the mixture of L-lysine and L-threonine.lysC1 was cloned into anE.coli-B revibacterium flavumshuttle expression vector pDXW-8 and transformed into wild typeB.lactofermentumA TCC13869.The recombinant strain A TCC13869/pDXW-8-lysC1 accumulated 7.5 g/L L-lysine after 90 h flask fermentation and 40 g/L after 72 h batch fermentation.These results would be very useful for constructing a genetically identified L-lysine producing strain with minimum genetic alterations.

book=593,ebook=289

Brevibacteriumlactofermentum, aspartate kinase, feedback inhibition,fermentation,L-lysine

Q 933

A

1673-1689(2011)04-0592-05

2010-03-25

國家863計劃項目(2007AA 02Z229和2007AA 02Z230)。

＊

王小元(1965-),男,山西垣曲人,教授,博士研究生導(dǎo)師,主要從事微生物學(xué)研究。Email:xiaoyuanwang@hotmail.com