孫 濤, 陳春紅, 謝 晶, 梁 齊

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306)

低聚殼聚糖與葡萄糖和麥芽糖的美拉德反應(yīng)及其衍生物的抗氧化性能

孫 濤, 陳春紅, 謝 晶, 梁 齊

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306)

低聚殼聚糖(COS)作為氨基供體分別與提供羰基的葡萄糖和麥芽糖進(jìn)行美拉德反應(yīng)(氨基與羰基的物質(zhì)量比均為3:1),考察了反應(yīng)過(guò)程中吸光度和熒光值的變化。醇沉法提取低聚殼聚糖美拉德反應(yīng)衍生物CG和CM。對(duì)兩種衍生物進(jìn)行紅外表征和相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定,并研究其對(duì)超氧陽(yáng)離子O2.-、DPPH自由基的清除能力以及還原能力。結(jié)果顯示:抗氧化能力強(qiáng)弱次序?yàn)镃G>CM>COS,即美拉德反應(yīng)后低聚殼聚糖衍生物抗氧化能力得到顯著提高,且CG的抗氧化活性優(yōu)于CM,表明與單糖進(jìn)行美拉德反應(yīng)制得的殼聚糖衍生物具有更好的抗氧化性。

低聚殼聚糖;美拉德反應(yīng);葡萄糖;麥芽糖;抗氧化性

美拉德反應(yīng)是多指發(fā)生在食品加工和貯存過(guò)程中還原糖的羰基與蛋白質(zhì)、氨基酸及一些含氮化合物的氨基產(chǎn)生的一系列復(fù)雜反應(yīng)的集合,在反應(yīng)過(guò)程中也會(huì)產(chǎn)生一些小分子化合物,如色素和熒光物質(zhì),使得體系的光吸收特征(包括紫外和可見(jiàn))及熒光特征增強(qiáng)。美拉德產(chǎn)物具有一定的抗氧化性能,其中某些物質(zhì)的抗氧化活性可以與食品中常用的抗氧化劑相媲美[1]。其產(chǎn)物結(jié)構(gòu)復(fù)雜、種類繁多,與反應(yīng)時(shí)間、溫度以及參與反應(yīng)的糖和氨基酸等有很大關(guān)系[2]。糖的結(jié)構(gòu)和種類會(huì)影響美拉德反應(yīng)發(fā)生的速率,一般而言,單糖的反應(yīng)速度要大于雙糖[3]。

低聚殼聚糖的抗氧化作用日益受到廣泛關(guān)注,由于含有大量游離氨基,殼聚糖可以作為氨基的供應(yīng)體與還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng)。還原糖中,單糖和雙糖易于發(fā)生美拉德反應(yīng),但美拉德產(chǎn)物的性質(zhì)有所差別[4]。作者以美拉德反應(yīng)作為低聚殼聚糖改性的手段,分別與葡萄糖和麥芽糖反應(yīng),制得低聚殼聚糖衍生物,考察了兩種衍生物對(duì)O2·-、DPPH的清除能力以及還原能力,為低聚殼聚糖的改性和天然高效抗氧化劑的開(kāi)發(fā)提供了新思路。

1 材料與方法

1.1原料與試劑

低聚殼聚糖:購(gòu)自浙江金殼生物化學(xué)有限公司;魯米諾,DPPH:購(gòu)自 Sigma公司;其余試劑:分析純,購(gòu)自上海化學(xué)試劑公司;抗氧化測(cè)試所需溶液由二次蒸餾水配制。

1.2 主要設(shè)備和儀器

WFZ UV 2000型紫外分光光度計(jì);970CRT熒光分光光度計(jì);EQUNOX55傅立葉紅外-拉曼光譜儀;Waters 515型凝膠色譜儀;IFFM 2D型流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析儀。

1.3 低聚殼聚糖衍生物的制備

稱取殼聚糖20.0 g兩份,分別加入葡萄糖和麥芽糖各6.67 g,使得殼聚糖氨基和葡萄糖以及麥芽糖的羰基物量比為3∶1。用200 m L的二次蒸餾水溶解,在80℃下回流反應(yīng),考察反應(yīng)過(guò)程中吸光度以及熒光值的變化。反應(yīng)8 h后,產(chǎn)物經(jīng)多次醇純,直至檢測(cè)產(chǎn)物中無(wú)葡萄糖和麥芽糖的存在,烘干得殼聚糖衍生物CG和CM。

1.4 測(cè)試表征

紅外光譜在 EQUNOX55傅立葉紅外-拉曼光譜儀上進(jìn)行,采用 KB r壓片法制樣,測(cè)定波數(shù)范圍為500～4 000 cm-1,分辨率為0.8 cm-1。

產(chǎn)物的相對(duì)平均分子質(zhì)量及其分布采用 GPC法測(cè)定。GPC測(cè)試條件如下:流動(dòng)相:0.1 mol/L硝酸鈉水溶液;監(jiān)測(cè)器:Waters 2410示差折光監(jiān)測(cè)器;柱子:U ltrahygrogel 500,120串連;溫度:40 ℃;標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為:葡聚糖。

1.5 抗氧化性能測(cè)定

1.5.1 對(duì)超氧陰離子自由基O2·-的清除 濃度為1.5×10-3mol/L的魯米諾溶液用p H=10.20的0.05 mol/L Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液配制,濃度為0.1 mol/L的鄰苯三酚儲(chǔ)備液用1×10-3mol/L的鹽酸配制,使用前用去離子水稀釋至1×10-4mol/L。以緩沖液作為溶劑,配制不同濃度的樣品溶液。用流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析儀依次測(cè)定從稀到濃的樣品溶液,讀出峰面積[5]。清除率=(A0-Ai)/A0×100%。其中A0為空白溶液峰面積;Ai為樣品溶液峰面積。經(jīng)SOD,過(guò)氧化氫酶及甘露醇檢測(cè),該體系產(chǎn)生的自由基為超氧陰離子O2·-。

1.5.2 對(duì)DPPH自由基的清除 在裝有2.0 m L的濃度為1×10-4mol/L DPPH無(wú)水乙醇溶液的比色管中,加入不同濃度的樣品溶液2.0 mL,室溫下避光靜置半小時(shí),在517 nm處測(cè)量吸光度Ai。用去離子水代替樣品溶液,得吸光度A0,無(wú)水乙醇代替DPPH,得吸光度Aj[6]。

1.5.3 還原能力的測(cè)定 還原能力根據(jù)文獻(xiàn)[7]測(cè)定并稍做改進(jìn)。取2.0 m L不同濃度的樣品,加入p H=6.60的0.2 mol/L磷酸緩沖液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%鐵氰化鉀溶液各2.5 mL,混勻,50℃水浴20 min后迅速冷卻,加入2.5 mL體積分?jǐn)?shù)10%三氯乙酸溶液,混勻后在3 000 r/min下離心10 m in,取上清液2.0 m L,加入2.5 m L去離子水和0.5 m L質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的三氯化鐵溶液,靜置10 min后在700 nm處測(cè)定吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 吸光度的變化

圖1和2描述了低聚殼聚糖分別與葡萄糖、麥芽糖反應(yīng)過(guò)程中的紫外-可見(jiàn)吸收光譜圖。由圖可知,在278 nm處吸收峰有明顯增加,表明有新的物質(zhì)生成并不斷積累,且與葡萄糖反應(yīng)的體系增幅較大,表明該體系物質(zhì)積累較快。在酸性條件下,美拉德反應(yīng)易發(fā)生糖的異構(gòu)和脫水,產(chǎn)生糠醛類物質(zhì)。羥甲基糠醛是美拉德反應(yīng)的標(biāo)示物,在280 nm左右存在特征吸收峰[8]。

圖1 低聚殼聚糖與葡萄糖美拉德反應(yīng)過(guò)程中吸光度的變化Fig.1 UV-Vis absorbance of Maillard reaction with glucose

圖2 低聚殼聚糖與麥芽糖美拉德反應(yīng)過(guò)程中吸光度的變化Fig.2 UV-Vis absorbance of Maillard reaction with maltose

2.2 熒光值的變化

圖3和4描述的是在美拉德反應(yīng)過(guò)程中,兩種體系在343 nm的激發(fā)波長(zhǎng)和435 nm發(fā)射波長(zhǎng)下測(cè)得的熒光值變化趨勢(shì)。隨著反應(yīng)的進(jìn)行,體系的熒光強(qiáng)度明顯增高,這表明具有熒光性質(zhì)的美拉德產(chǎn)物的產(chǎn)生和積累,且與葡萄糖反應(yīng)的體系在反應(yīng)前期熒光值增幅較大,表明該物質(zhì)積累較快。熒光物質(zhì)被視為美拉德反應(yīng)的指示劑,因?yàn)樗鼈冹`敏地反映了美拉德反應(yīng)的早期過(guò)程[9],反應(yīng)后期熒光物質(zhì)將參與類黑素等大分子的形成,所以隨著反應(yīng)進(jìn)行,熒光物質(zhì)的積累會(huì)越來(lái)越少[10]。

2.3 低聚殼聚糖衍生物的測(cè)試表征

圖5是低聚殼聚糖及其衍生物(CG與CM)的紅外光譜圖。殼聚糖及兩種衍生物在1 100 cm-1附近都有3個(gè)較強(qiáng)的多糖特征吸收峰,分別是1 037 cm-1、1 085 cm-1、1 155 cm-1,這些吸收峰都來(lái)自殼聚糖主鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu),可作為判定低聚殼聚糖及其衍生物存在的特征吸收峰[11]。殼低聚糖在1 622、1 516和1 381cm-1附近的吸附帶,分別歸因于酰胺 I(C=O)、自由氨基(-NH2)和酰胺Ⅲ[12]。圖中顯示低聚殼聚糖美拉德衍生物在1516 cm-1的峰較低聚殼聚糖有明顯降低,表明了自由氨基的減少;同時(shí),在1155和896cm-1處的吸收峰,分別歸因于C-O伸縮振動(dòng)和β-D-氨基葡萄糖結(jié)構(gòu),當(dāng)加入葡萄糖進(jìn)行美拉德反應(yīng)后,該處吸收峰漸漸降低,表明殼聚糖的糖單元發(fā)生了變化[4]。

圖3 低聚殼聚糖與葡萄糖美拉德反應(yīng)的過(guò)程中熒光值的變化Fig.3 Fluorescence absorbance of Maillard reaction with glucose

圖4 低聚殼聚糖與麥芽糖美拉德反應(yīng)的過(guò)程中熒光值的變化Fig.4 Fluorescence absorbance of Maillard reaction with maltose

采用 GPC法,測(cè)得樣品低聚殼聚糖的相對(duì)分子質(zhì)量為8 190,低聚殼聚糖衍生物CG和CM的相對(duì)分子質(zhì)量分別為11 800和9 880。美拉德衍生物的相對(duì)分子質(zhì)量較低聚殼聚糖都有所增加,表明殼低聚糖分子中的游離氨基酸和還原糖基團(tuán)相互反應(yīng)形成了更大的分子。

圖5 低聚殼聚糖及3種低聚殼聚糖美拉德衍生物的紅外光譜圖Fig.5 FTIR spectra of COS,CGand CM

2.4 超氧陰離子自由基O2·-清除

圖6描述了低聚殼聚糖及其衍生物對(duì)O2·-的清除效果。兩種衍生物CG和CM對(duì)于O2·-的清除能力均隨著濃度的增加,其IC50(對(duì)自由基清除率為50%時(shí)所需要的自由基清除劑濃度)分別為0.077和0.092 mmol/L,而低聚殼聚糖的 IC50為0.196 mmol/L,可見(jiàn)兩種衍生物對(duì)O2·-的清除能力優(yōu)于低聚殼聚糖,且CG的清除能力優(yōu)于CM。研究表明,低聚殼聚糖對(duì)O2·-的清除活性可能與其分子中的活性羥基和氨基有關(guān)[13],低聚殼聚糖作為氨基的供體與提供羰基的葡萄糖和麥芽糖發(fā)生美拉德反應(yīng),與低聚殼聚糖相比,其活性氨基含量下降,但其衍生物對(duì)O2·-的清除能力有所提升。相比麥芽糖,低聚殼聚糖與葡萄糖生成的衍生物對(duì)O2·-清除能力更強(qiáng),這可能是由于低聚殼聚糖是大分子物質(zhì),分子鏈較長(zhǎng),當(dāng)殼聚糖的氨基與兩種糖的羰基物質(zhì)量比相同時(shí),葡萄糖作為單糖,分子較小,易于進(jìn)攻殼聚糖的羰基,使得衍生物具有更好的抗氧化活性。

2.5 對(duì)DPPH自由基的清除

圖7描述了殼聚糖及其衍生物對(duì)DPPH自由基的清除能力。由圖可知,CG、CM和COS的 IC50分別為 0.026、0.051以及 0.144 mmol/L,即抗氧化能力CG>CM>COS。這一結(jié)果同樣與對(duì)O2·-的清除結(jié)果相仿。

2.6 還原能力的測(cè)定

還原能力是表示抗氧化物質(zhì)提供電子能力的重要指標(biāo),通過(guò)提供電子,阻斷了Fe2+向Fe3+的轉(zhuǎn)變,從而表現(xiàn)出一定的還原能力。研究表明,抗氧化活性和還原能力之間存在著密切的關(guān)系[14]。如圖8所示,在濃度為0.20 mmol/L時(shí),COS、CG和CM的吸光度分別為0.328、0.865和0.625,還原能力強(qiáng)弱順序?yàn)镃G>CM>COS,這與前面的結(jié)果保持一致。

圖6 低聚殼聚糖及兩種美拉德衍生物對(duì)O2·-的清除能力Fig.6 Scavenging activity of COS,CG and CM on superoxide radicals

圖7 低聚殼聚糖及兩種美拉德衍生物對(duì)DPPH的清除能力Fig.7 Scavenging activity of COS,CG and CM on DPPH radicals

圖8 低聚殼聚糖及兩種美拉德衍生物的還原能力Fig.8 Reducing power of COS,CG and CM

3 結(jié) 語(yǔ)

作者以美拉德反應(yīng)為低聚殼聚糖的改性手段,分別與葡萄糖和麥芽糖反應(yīng)來(lái)制備低聚殼聚糖衍生物,并檢測(cè)了低聚殼聚糖及其衍生物對(duì)O2·-、DPPH的清除能力以及還原能力。結(jié)果顯示,衍生物的抗氧化性均優(yōu)于低聚殼聚糖,故可以認(rèn)為美拉德反應(yīng)是低聚殼聚糖改性的有效手段;低聚殼聚糖與葡萄糖美拉德反應(yīng)的衍生物抗氧化性更強(qiáng),這可能是由于單糖的分子較雙糖小,更易于向氨基進(jìn)攻發(fā)生美拉德反應(yīng),生成的衍生物抗氧化性能也更強(qiáng)。表明低聚殼聚糖與葡萄糖的美拉德反應(yīng)是提高抗氧化性更有效的手段,其機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。本研究為制備天然、安全、高效的抗氧化劑提供了一定的參考依據(jù)。

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Maillard Reaction between Chitosan Oligosaccharide and Glucose/Maltose and the Antioxidant Activity of the Derivatives

SUN Tao, CHEN Chun-hong, XIE Jing, LIANG Qi
(College of Food Science and Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China)

Maillard reaction was occured by heating chitosan oligosaccharide(COS)with glucose and maltose separately(the ratio of —NH2and —OH was 3∶1).The absorbance and fluorescence were determined during the reaction. Two kinds of chitosan oligosaccharide derivatives were extracted,named CG and CM.Chitosan oligosaccharide derivatives were characterized by FTIR and their molecular weight was determined by GPC.Their antioxidant activity was investigated by employing various established in vitro system s,such as superoxide/1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)radicals scavenging and reducing power.The results showed two kinds of the chitosan oligosaccharide derivatives showed strong antioxidant activity compared with chitosan oligosaccharide.The antioxidant activity was found to be in the order of CG>CM>COS,which indicated that the derivatives prepared by monosaccharide had the better antioxidant activity.

chitosan oligosaccharide,Maillard reaction,glucose,maltose,antioxidant activity

孫濤 (1970-),女,黑龍江依蘭人,工學(xué)博士,副教授,主要從事多糖改性及生物功能研究。Email:taosun@shou.edu.cn

R 284;Q 539;TS 202.3

A

1673-1689(2011)04-0556-05

2010-06-04

上海市生物醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)科技領(lǐng)域重點(diǎn)科技項(xiàng)目(08391911500);2009年上海市優(yōu)秀學(xué)科帶頭人計(jì)劃(09XD1402000);上海市教委重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(J50704)。